Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒

试剂盒组成

（1） 支原体引物和内参（100次）：200 μL

（2） 阳性支原体DNA：50 μL


注意1：本试剂盒提供的支原体引物和内参可供至少100次支原体检测使用。

       2：以下试剂需要自己准备：（1）灭菌的去离子水；（2）普通的Taq DNA 聚合酶和相应的缓冲液；（3）2.5 mM的dNTP；（4）6× DNA上样缓冲液。
 

使用方法

1、待测样品的准备

为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品来源于至少培养3天且汇合度在70-90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，至少让细胞生长3天再取培养液进行检测。取150 μL上述待测样品，在普通台式离心机上1200 rpm (大约150-200 g)离心5 min，取离心后的上清100 μL用于支原体检测，丢弃下层剩余的50 μL（含细胞沉淀）。收集并已经离心去除细胞的待测样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月，在-80℃基本可以长期保存。

注意：本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞，以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来，从而导致假阴性。
 

2、PCR体系的配制。请按下表进行PCR体系（总体积25 μL）配制:

3、PCR设置参数

4、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

（1） 配制1.5% DNA琼脂糖凝胶。安全起见，建议选用李记生物的GelRe的核酸染料。

（2） 往每个PCR管内加入5 μL 6× DNA上样缓冲液。

（3） 取上述含DNA上样缓冲液的PCR产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

（4） 当溴酚蓝染料跑出3厘米左右时，停止电泳，拍照。
 

结果判断

  PCR扩增的结果有可能出现以下几种情况：

       注：“-”代表没有条带；“+”代表有条带；“+”号越多代表条带越强。

图1. 支原体PCR扩增结果。586 bp条带为内参条带，270 bp左右的条带为支原体特异条带（各支原体的条带大小会略有不同，总体在260-280 bp）。随着支原体DNA模板的增加，270 bp左右的条带会逐渐增强而586 bp的内参条带会逐渐减弱，甚至消失。泳道1：阴性对照或者没有支原体污染的样品；泳道2：极重度支原体污染样品；泳道3：重度污染样品；泳道4：中度污染样品；泳道5：轻度污染样品；泳道6：PCR的扩增被细胞的代谢产物YZ，导致扩增失败。M：DNA marker.
 

注意事项

1、每次检测都应该设有阴性对照，作用有：（1）阴性对照会有一条586 bp的内参条带，这样可以验证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及自己准备的Taq DNA 聚合酶，dNTP等试剂没有问题；（2）只有当阴性对照的结果没有出现270 bp左右的支原体特异条带时，别的样品的结果才是可信的。
 

2、如果586 bp条带和270 bp左右的条带都没有出现（如图1，泳道6），在排除PCR试剂的问题后（即阴性对照可以正常扩增），说明该样品含有YZPCR扩增的代谢产物。有关PCR的扩增会被细胞的代谢产物YZ的问题，Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（货号MP0035）的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点，说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题，其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。这也是PCR法支原体检测的致命弱点。为了克服该问题，以下问题必须注意：（1）您购买的PCR法支原体检测试剂盒，其扩增产物中必须含有内参（Internal Contol）条带作为对照【本试剂盒的586 bp条带就是内参条带】。否则，如果没有内参作为对照，即使样品扩增后没有支原体特异条带，你也无法确定是因为样品确实没有支原体还是因为PCR被细胞的代谢产物YZ导致的假阴性。（2）如果出现PCR的扩增被细胞的代谢产物YZ时，请使用血液基因组DNA抽提试剂盒，抽提支原体DNA后再进行PCR鉴定。（3）同时使用本公司生产的《Quick Cell支原体快速检测试剂盒》进行检测，经严格测试，该试剂盒的扩增不会被细胞的代谢产物YZ。
 

3、根据支原体DNA的序列，本试剂盒可以识别所有100多种至今已发现的支原体，具有广谱的识别能力。
 

4、如发现细胞被支原体污染，本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂。