HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）

HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）产品描述

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的ZX，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可获取的树脂之一。

HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）产品性质

基质（Matrix）

高度交联的4%琼脂糖凝胶

孔径（Bead size）

45-165µm

载量（Capacity）

＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质

耐压（Tolerance Pressuremax）

0.1MPa, 1bar

储存缓冲液（Buffer）

含20%乙醇的1×PBS

运输和保存方法

冰袋运输。4℃保存。有效期2年。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）使用方法

（一）纯化流程

1 缓冲液的准备

缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前用0.22µm或0.45µm滤膜过滤CJ。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2 样品准备

2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）

1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。

2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶YZ剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。

3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

5）收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清0.22µm或0.45µm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

【注】：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。

2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）

1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。

2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。

3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。

4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。

5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3样品纯化

1）装柱：将HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。

2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。

3）平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。

4）上样：注意控制加样速度，确保目的蛋白与Ni2+充分接触，以提高纯化得率。

【注】：注意收集流出液，用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。

5）平衡/洗杂：Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。注意收集流出液。

【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。

6）洗脱：使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。

7）清洗：依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。

【注】：建议在清洗之前用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。

8）保存：5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，ZH将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗

当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。ZH利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白

使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生

当填料使用过程中发现反压过高，填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；

2）去离子水清洗5倍柱体积；

3）2%SDS清洗3倍柱体积；

4）去离子水清洗5倍柱体积；

5）乙醇清洗5倍柱体积；

6）去离子水清洗5倍柱体积；

7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；

8）去离子水清洗5倍柱体积；

9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；

10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer (pH8.0)

50mM NaH2PO4

300mM NaCl

10 mM imidazole

NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ

NaH2PO4 ·2H2O    7.8g

NaCl             17.54g

Imidazole         0.68g

Wash Buffer (pH8.0)

50mM NaH2PO4

300mM NaCl

20 mM imidazole

NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ

NaH2PO4 ·2H2O    7.8g

NaCl             17.54g

Imidazole         1.36g

Elution Buffer(pH8.0)

50mM NaH2PO4

300mM NaCl

250 mM imidazole

NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ

NaH2PO4 ·2H2O    7.8g

NaCl             17.54g

Imidazole         17.0g

 

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer (pH8.0)

8M Urea

100mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ

Urea             480.5g

NaH2PO4 ·2H2O    15.6g

Tris              15.76g

Wash Buffer (pH6.3)

8M Urea

100mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至6.3, 0.22µm或0.45µm过滤CJ

Urea             480.5g

NaH2PO4 ·2H2O    15.6g

Tris              15.76g

Elution Buffer(pH4.50)

8M Urea

100mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至4.5, 0.22µm或0.45µm过滤CJ

Urea             480.5g

NaH2PO4 ·2H2O    15.6g

Tris              15.76g



附表3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况

试剂种类

浓度

还原剂

5mM DTE

0.5-1 mM DTT

20mM β-mercaptoethanol

5mM TCEP

10mM reduced glutathione

变性剂

8M urea

6M Gua-HCl

去污剂

2% TritonTM X-100(nonionic)

2% TweenTM20(nonionic)

2% NP-40(nonionic)

2% Cholate (anionic)

1% CHAPS (zwitterionic)

其他类

500mM imidazole

20% ethanol

50% glycerol

100mM Na2SO4

1.5M NaCl

1mM EDTA

60mM citrate

缓冲液

50mM sodium phosphate, pH7.4

100mM Tris-HCl, pH7.4

100mM Tris-acetate, pH7.4

100mM HEPES, pH7.4

100mM MOPS, pH7.4

100mM sodium acetate, pH7.4

 

附表4 问题及解决方案

问题

可能原因

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

裂解液中可能含微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22µm或0.45µm）过滤，或离心去除。

样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI （终浓度为5µg/ml），Mg2+(终浓度1mM)，冰上孵育10-15min

样品太黏稠

有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压ZG，降低操作流速。

洗脱组分中无目的蛋白

蛋白可能是包涵体

可通过电泳检测裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式

表达量太低

优化表达条件，使用包涵体纯化缓冲体系

目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤中已被洗下来

提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑浓度

目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来

降低Elution Buffer 的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度

使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到蛋白

蛋白降解

菌体破碎时需添加一些蛋白酶YZ剂

在4℃下进行纯化操作

洗脱组分不纯（含多种蛋白）

洗杂不彻底

增加Wash Buffer 体积

样品中含有其他His标签蛋白

通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段（如去离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。

填料颜色变浅或变成白色

镍离子脱落或者剥离

按照填料再生的操作重新挂镍离子

填料呈现褐色

缓冲液中含有DTT等还原剂

参考附3适当降低还原剂DTT的浓度，或改用巯基乙醇

上样过程中蛋白发生沉淀

操作温度太低

室温下进行上样

 

蛋白发生聚集

在样品和所有缓冲液中添加稳定剂，如0.1%Triton X-100或Tween-20
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）yb-15027R    C1orf1491号染色体开放阅读框149抗体    浓度1mg/ml
yb-12915R    phospho-c-Kit(Tyr823)磷酸化原癌基因c-kit抗体    浓度1mg/ml
yb-12916R    phospho-c-Kit(Tyr568 + Tyr570)磷酸化原癌基因c-kit抗体    浓度1mg/ml
yb-12918R    phospho-C-REL (Ser503)磷酸化淋巴细胞衍生C-型凝集素抗体    浓度1mg/ml
yb-15149R    C2orf392号染色体开放阅读框39抗体    浓度1mg/ml
yb-15150R    C2orf492号染色体开放阅读框49抗体    浓度1mg/ml
yb-15151R    C2orf502号染色体开放阅读框50抗体    浓度1mg/ml
yb-13095R    ERCC8科凯恩氏综合症相关蛋白/早衰蛋白CSA抗体    浓度1mg/ml
yb-12919R    phospho-Cytokeratin 8 (Ser73)磷酸化细胞角蛋白8抗体    浓度1mg/ml
yb-12920R    phospho-Cytokeratin 8 (Ser431)磷酸化细胞角蛋白8抗体    浓度1mg/ml
yb-12921R    phospho-CK18(Ser52)磷酸化细胞角蛋白18抗体    浓度1mg/ml
yb-12922R    Cytohesin 2胞粘蛋白2抗体    浓度1mg/ml
yb-12923R    Cytochrome P450 2A6细胞色素CPA6抗体    浓度1mg/ml
yb-12924R    CYP3A1细胞色素CYP3A抗体    浓度1mg/ml
yb-12927R    CYP20A1细胞色素cP450 CYP20A1抗体    浓度1mg/ml
yb-12926R    CYP1B1细胞色素cP4501B1抗体    浓度1mg/ml
yb-12928R    CYP26A1细胞色素cP450 CYP26A1抗体    浓度1mg/ml
yb-12929R    phospho-Cyclin E(Thr77)磷酸化周期素E抗体    浓度1mg/ml
yb-12930R    phospho-Cyclin E2 (Thr392)磷酸化周期素E2抗体    浓度1mg/ml
yb-12045R    Cyclin M3周期素M3抗体    浓度1mg/ml
yb-12060R    Cyclin Y周期素Y/X抗体    浓度1mg/ml
yb-12155R    phospho-Cyclin D3 (Thr283)磷酸化周期素D3抗体    浓度1mg/ml
yb-12162R    CYB5R3细胞色素b5还原酶3抗体    浓度1mg/ml
yb-11464R    CWC22CWC22蛋白抗体    浓度1mg/ml