SYA169 甲型/乙型/丙型流感病毒三重荧光

特别提示：包括甲型/乙型/丙型流感病毒三重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：甲型/乙型/丙型流感病毒三重荧光PCR检测试剂盒

产品货号：SYA169

产品规格：48次/盒







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人副流感病毒4型单重荧光PCR检测试剂盒说明书

一、简介：

人副流感病毒(Parainfluenza viruses，PIVs)，是一种常常引起儿童下呼吸道感染的单链的RNA病毒，属于副黏病毒。本试剂盒用一对人副流感病毒4 型特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR 技术对人副流感病毒4 型RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中人副流感病毒4 型(PIV4)的探针报告基团为FAM。



二、用途：

本试剂盒适用于各种咽拭子、鼻拭子等临床样品中人副流感病毒4 型的特异性检测。适用于人副流感病毒4 型感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供临床参考。



三、试剂盒组成：(48T)

组份 数量 规格

人副流感病毒4型反应液(PIV4-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管

酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管

无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管

阴性对照(NTC) 1管 50μL/管

人副流感病毒4 型阳性对照(PIV4-PTC) 1管 50μL/管



四、储存条件及有效期：

本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月，反复冻融次数不宜超过5次。



五、荧光PCR仪器适用范围：

ABI系列，Stratagene MX系列，Bio-Rad系列等荧光定量PCR检测仪等。



六、样品的采集与RNA提取

6.1 样品的采集

按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。

6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。

6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。

6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。

6.2 RNA提取

可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的RNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。

 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL 加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。



七、检测步骤：

7.1 试剂的准备

从试剂盒中取出荧光qRT-PCR 反应液(PIV4-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm 离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量

荧光PCR反应液 14µL N×14µL

酶混合物 1µL N×1µL

总量 15µL N×15µL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm 离心10s，向设定的N 个PCR 反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照PIV4-PTC)5μL，10000rpm 瞬时离心10 秒。

7.2 qRT-PCR反应条件

将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。

推荐循环条件:

反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min

预变性 1循环 95℃ for 10 min

PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec

60℃ for 45 sec

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。其中FAM基团检测PIV4，淬灭基团为None。



八、结果分析：

8.1 结果分析条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。

8.2 试验成立判定

(1) 阴性对照(NTC)：FAM和HEX/VIC/JOE通道全部阴性。

(2) 阳性对照(PIV4-PTC)：FAM和HEX/VIC/JOE通道均有扩增曲线。

以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效

8.3 结果判定

FAM通道：Ct值≤35，人副流感病毒PIV4亚型核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明人副流感病毒PIV4亚型核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明人副流感病毒PIV4亚型核酸阳性；否则判为样本阴性。



九、注意事项：

(1) 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。

(2) 所有使用的离心管zuì好高压灭菌，而且必须不含RNA 酶。

(3) PCR 操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR 扩增区等)，防止实验室污染。

(4) 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。

(5) 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。





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