WE0198 动物组织/细胞RNA提取试剂盒

特别提示：包括动物组织/细胞RNA提取试剂盒(含DNase I)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：动物组织/细胞RNA提取试剂盒(含DNase I)

英文名称：RNAtiqu Tissue&Cell RNA Extraction Kit(DNase I)

产品货号：WE0198

产品规格：50次



  本试剂盒将GX的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中GX提取总RNA。起始样本一般zuì多30 mg组织或1x107细胞。本试剂盒还可回收未完全纯化的RNA、体外转录和酶促反应后得到的RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于200碱基的高品质RNA，几乎无DNA残留。如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于RT-PCR、 Nothern Blot、Dot Blot等下游实验。



试剂盒组成：

组份	50次
DNase I	1000 U
10×Reaction Buffer	1000μl
Buffer RL	35ml
Buffer RW1	30ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
吸附柱RM及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

保存条件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它组分室温(15～30℃)。



自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇(新开封或提取RNA专用)。



实验前准备及重要注意事项：

1、预防RNase污染，应注意以下几方面：

1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

2)配制溶液应使用无RNase的水。

3)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2、提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。

3、Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。

4、次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。

5、Buffer RL如果产生沉淀，可于56℃加热使其溶解后室温放置。

6、所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。



操作步骤：

1、样品处理

① 组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600μl Buffer RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇)，组织样本少于20 mg加350μl Buffer RL。样品体积不超过Buffer RL体积的十分之一。

② 单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6-10cm2培养面积加入600μl Buffer RL，小于6cm2加入350μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。

③ 细胞悬液：12000rpm(～～13400×g)离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每5×106-1×107细胞加入600μl Buffer RL，少于5×106细胞加入350μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。

注意：

① 尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能YZ细胞的裂解影响RNA产量。

② 尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。

2、样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

3、12000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。

4、向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积(600μl 或350μl)的70%乙醇(无RNase水配制)，混匀。

注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。

5、将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12000rpm离心1分钟，弃废液。将吸附柱放回收集管中。

注意：吸附柱的zuì大载量为100μg，不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。

6、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7、配制DNase I 混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混匀， 配制成终体积为80μl的反应液。

8、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。

9、向吸附柱中加入200μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇), 12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

11、重复步骤10。

12、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

13、将吸附柱转入新的离心管中，向吸附膜中间位置加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：

① RNase-Free Wate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。

② 如果要提高RNA的产量，可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤13。

③ 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。



储存条件：室温(15～30℃)。



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名称：动物RNA提取试剂盒(柱式Trizol)

货号：BTN71201

规格：50次

本试剂盒是动物总RNA快速提取试剂动物RNA提取试剂盒(BTN3070)的柱式升级产品，可用于从各种动物组织(包括白细胞)快速提取总RNA。



试剂盒特点：

1. 操作更加简单快速，整个过程只需要不到十分钟(对一个样品而言)。

2. RNA 纯度更高，OD260/OD280一般在2.0左右。

3.一般不含用RT-PCR可以检测到的基因组DNA污染。

4.适用于培养细胞、大部分动物组织和部分植物组织。

5. 得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA 合成等实验。

6. 性价比高于进口的柱式RNA提取产品。



试剂盒组成：

成分	50T
溶液A	50ml
溶液B	25ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
RNA 洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。



使用方法：

下面的操作步骤是针对在1.5mL塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。



1. 根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用：

a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10 平方厘米细胞中加入1mL溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。

b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106 悬浮细胞中加入1mL溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1mL溶液A的细胞使用量不要超过1×106个细胞。

c)对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10mL或15mL塑料离心管中，每50-100mg 组织加1mL溶液A，用匀浆器匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细胞中含大量正在复制的DNA)，建议组织的使用量不要超过50mg/ mL溶液A，否则十分容易产生DNA污染。

d)对RNAhold 保存组织：先用纸吸去RNAhold液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。

2. 将裂解物转移至一个干净的1.5mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备氯fǎng(1mL溶液A需0.2mL 氯fǎng)，振荡器上充分振荡混均30秒。

3. 12000rpm室温离心3～5分钟。

4. 将上清液(约0.6-0.8mL的无色透明水相，有时水相比重大时，水相在下层，有机相即蓝相在上层，吸取时应吸取透明水相)转移到一个干净的1.5mL塑料离心管中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100μl上清液不取。同时吸取上清时zuì好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。

5. 加入等体积的溶液B，充分颠倒混匀。

6. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。

7. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。

8. 加0.7mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。

9. 加0.3mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。

10.室温12000 rmp离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的使用。

11. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 收集管中，加入50-100μL RNA 洗脱液。

12.室温12000 rmp离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

13. RNA的电泳检测：本试剂盒提取的RNA zuì好用甲醛变性胶电泳，如果在非变性的普通琼脂糖胶(in TAE或TBE buffer)上电泳，一定要使用RNA 专用上样液RNAload(操作详见RNAload 使用手册)，千万不要使用常用的DNA上样液，因为DNA上样液没有经过去RNase处理，也不能将RNA变性，得到的带型将十分杂乱。

14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。

15. RNA产量产率测定：将5-10μl RNA 溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度×体积)和产率(RNA产量/组织用量)。

16. RNA 纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。



疑难解答：

Q：上样孔里的红色荧光物一定是DNA污染吗？

A：不是。用TAE或TBE电泳液和非变性胶电泳RNA时容易产生此现象，我们初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合(如果使用TBE作电泳液的话)形成的复合物，加RNase处理后，这些红色荧光物(RNA)一般会消失。为避免此现象，建议zuì好使用甲醛变性胶电泳和RNA 专用上样液(如RNAload)。

Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？

A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase处理RNA样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用百奥莱博的非酶的DNA去除剂DNA Scavenger或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有残留的RNase污染，所以必须严格按照厂家提供的使用说明书进行操作。



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