WH0111 一步法RT-qPCR试剂盒（探针

特别提示：包括一步法RT-qPCR试剂盒（探针法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：一步法RT-qPCR试剂盒（探针法)

英文名称：QuickKing One Step RT-qPCR Kit（Probe)

产品货号：WH0111

产品规格：50μl×50次|50μl×200次



本试剂盒是采用探针法（TaqMan,Molecular Beacon等)进行一步法RT-qPCR的专用试剂。使用本制品进行Real Time One Step RT-qPCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，避免了样品间交叉污染的同时也提高了检测的灵敏度。



本试剂盒中的25×QuickKing Enzyme Mix为我司新型逆转录酶（King RTase)、新型抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶及RNase Inhibitor的预混Mix形式，其中的King RTase是分子改造后的新型逆转录酶，特别增加了疏水motif，具有更强的RNA亲和性和热稳定性，提高了该酶的逆转录效率和对具有复杂二级结构RNA模板的延伸能力；PCR过程中采用了性能优良的新型热启动Taq DNA聚合酶，使得逆转录后的PCR反应具更高的扩增效率和特异性。另外，本产品中的2×QuickKing One Step Probe RT-qPCR Master Mix是专门为上述两种关键酶而优化的新型反应体系，其中包含必要离子组分、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂，可保证King RTase和新型热启动Taq DNA聚合酶在整个一步法反应过程中发挥zuì大功效。



本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对多种高低丰度的靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。RT-qPCR技术可用于检测样本中目的基因表达水平及RNA病毒的含量。



产品特点：

·反应灵敏GX：性能优良的逆转录酶和Taq酶保证了极高的反应效率；

·操作简单快速：双组分的产品形式使得操作过程变得简单快速；

·解决复杂模板：通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板；

·样品普适性好：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高。



试剂盒组成：

组分	50μl×50次	50μl×200次
2×RT-qPCR MasterMix	1.25ml	4×1.25ml
25×QuickKing Enzyme Mix	100μl	400 μl
50×ROX Reference Dye	250μl	1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml

储存条件：-20℃保存，保质期1年。



适用的Real Time PCR扩增仪：

PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast RealTime PCR System,Viia 7 （Applied Biosystems)

OPTICONTM/CFX96 （BIORAD)

Light Cycler 480 （Roche)

Smart Cycler? System （Cepheid)

Mx3000P/Mx3005P （Stratagene)

其他各种Real Time PCR扩增仪



注意事项：

1.RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用我公司的RNA提取试剂盒制备高质量的总RNA。

2.一步法RT-qPCR实验应避免RNase污染，可采用以下措施：

①因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应佩戴一次性手套和口罩；

②一步法RT-qPCR实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；

③一步法RT-qPCR实验相关耗材应用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12h，并高压灭菌30min后使用。

3.25×QuickKing Enzyme Mix在取用之前应短暂离心收集溶液后再吸取，吸取时动做要慢，使用后应尽快放回-20℃。

4.2×QuickKing One Step Probe RT-qPCR Master Mix在取用前应充分混匀并离心后使用。

5.本试剂盒必须使用特异性引物，引物可根据具体实验来选择。



操作步骤：

1.完全融化模板RNA，特异性引物，2×RT-qPCR MasterMix、50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH2O，短暂离心后置于冰浴上。

2.按下表在冰浴条件下配制反应液（50μl体系)：

成分	使用量
2× RT-qPCR MasterMix	25 μl
25×QuickKing Enzyme Mix	2 μl
上游特异性引物（10μM)	1.25 μl①
下游特异性引物（10μM)	1.25 μl①
探针（10μM)	1.0 μl②
RNA模板	10pg-1μg total RNA
50×ROX Reference Dye③	跟据不同仪器添加
RNase-Free ddH2O	补水至50 μl

①引物终浓度为0.25 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.05-0.90 μM范围内调整。

②探针的浓度与使用的Real-Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用说明进行。通常探针终浓度为0.20 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。需要进一步优化探针浓度的，可以在0.10-0.50 μM范围内调整。

③几种常见仪器的zuì适ROX Reference Dye浓度如下：

 ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等：5×（例如：5μl ROX/50μl体系)；

 ABI 7500、7500 Fast、Viia 7；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1μl ROX/50μl体系)；

 Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等：不用添加。

3.进行Real Time One Step RT-qPCR反应

  PCR反应管请用离心机瞬时离心后放入荧光定量PCR仪中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的标准PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。反应步骤（建议）如下：

反应温度	反应时间	反应循环数	说明
50℃	30min	1	逆转录
95℃	3min	1	预变性
95℃	15sec	40	PCR循环步骤， 请在该步骤收集荧光
60℃	30sec

4.实验结果分析

  反应结束后确认Real Time One Step RT-qPCR的扩增曲线、CT值、标准曲线等，并进行RT-qPCR定量结果分析。



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