SYA207 脊髓灰质炎病毒3型单重荧光PCR

特别提示：包括脊髓灰质炎病毒3型单重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：脊髓灰质炎病毒3型单重荧光PCR检测试剂盒

产品货号：SYA207

产品规格：48次/盒







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一、简介

本试剂盒用一对甲型流感病毒特异性引物，一对甲型H1N1特异性引物，分别结合一条特异性荧光探针，用一步法双重荧光RT-PCR技术对甲型流感病毒RNA、流感H1N1病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中甲型流感病毒的探针报告基团为VIC/HEX/JOE，流感H1N1病毒的探针报告基团为FAM。



二、用途：

本试剂盒适用于检测各种咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、组织样品等临床样品中甲型流感病毒和H1N1亚型流感病毒。可用于甲型流感病毒和H1N1亚型感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供参考。



二、试剂盒组成(48T)

组份 数量 规格

甲型流感/H1N1荧光qRT-PCR反应液(IAV-A/H1N1-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管

酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管

无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管

阴性对照(NTC) 1 管 50μL/管

阳性对照(IAV-A/H1N1-PTC) 1 管 50μL/管



四、储存条件及有效期：

本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。



五、荧光PCR仪器适用范围：

ABI7500荧光定量PCR检测仪。



六、样品的采集与RNA提取

6.1 样品的采集

按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。

6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。

6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500µL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。

6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。

6.2 样品RNA提取

可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的RNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。

 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。



七、检测步骤

7.1 试剂的准备

从试剂盒中取出荧光RT-PCR反应液(IAV-A/H1N1-RT-PCR MIX)、酶混合液(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量

荧光PCR反应液 14µL N×14µL

酶混合液 1 µL N×1 µL

总量 15µL N×15µL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(IAV-A/H1N1-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。总体系20µL。

7.2 real time RT-PCR反应条件

将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。

推荐循环条件:

反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min

预变性 1循环 95℃ for 10 min

PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec

60℃ for 45 sec

在60℃延伸时收集荧光信号 报告基团：设置为FAM和VIC(若仪器无VIC通道，可选择HEX或JOE通道)。其中FAM基团检测H1N1，VIC/HEX/JOE基团检测IAV-A，淬灭基团均为None，请勿选择ROX参比荧光。



八、结果分析

8.1 结果分析条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。

8.2 试验成立判定

（1） 阴性对照(NTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道全部阴性。

（2） 阳性对照(IAV-A/H1N1-PTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均有扩增曲线。

（3） 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。

8.3 结果判定

（1） FAM通道：Ct值≤35 H1N1亚型流感病毒核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明H1N1亚型流感病毒核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明H1N1亚型流感病毒核酸阳性；否则判为样本阴性。

（2） HEX/VIC/JOE通道：Ct值≤35 甲型流感病毒核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明甲型流感病毒核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明甲型流感病毒核酸阳性；否则判为样本阴性。



九、注意事项：

（1） 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。

（2） 所有使用的离心管zuì好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。

（3） PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。

（4） 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。

（5） 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。