特别提示:包括副溶血性弧菌不耐热溶血毒素(TLH)单重荧光PCR检测试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床YL及其他非科研用途!
产品名称:副溶血性弧菌不耐热溶血毒素(TLH)单重荧光PCR检测试剂盒
产品货号:SYA070
产品规格:48次/盒
一、简介:
本试剂盒用一对副溶血性弧菌不耐热溶血毒素特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光PCR技术对副溶血性弧菌不耐热溶血毒素的核酸进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
二、用途:
该试剂盒适用于检测水样粪便、疑似污染的水、食物等样本中的副溶血性弧菌不耐热溶血毒素(TLH),用于副溶血性弧菌不耐热溶血毒素(TLH)感染的辅助诊断,其检测结果仅供临床参考。
三、试剂盒组成:(48T)
组份 | 数量 | 规格 | TLH反应液(TLH-qPCR MIX) | 1管 | 672μL/管 | DNA抽提液(DNA Extraction) | 2管 | 1.5mL/管 | 酶混合物(Enzymes MIX) | 1管 | 48μL/管 | 阴性对照(NTC) | 1管 | 50μL/管 | TLH阳性对照(TLH -PTC) | 1管 | 50μL/管 |
四、荧光PCR 仪器适用范围
ABI系列、MJ系列、Roche系列,博日系列及其他荧光定量PCR 检测仪。
五、储存条件及有效期:
本试剂盒于-20℃以下保存,有效期为6个月。
六、样品采集、前处理与DNA 提取
6.1 样品采集
水样便取0.5-1 mL;疑似污染的食物取1g。
6.2 样本前处理:
水样便13000rpm离心2min,去尽上清;疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm离心2min,取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中;疑似污染的水直接取100μL。
6.3 DNA提取
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液,按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的(DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套),并按照相应试剂盒说明进行操作。
对上述处理好的样本加入50uL核酸提取液,100℃恒温处理10min,13000rpm离心5min,取上清液转移至新的1.5mL EP管,-20℃保存;
注:阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取),直接取5μL加入到反应体系中即可。
由于阳性对照浓度较高,建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。
七、检测步骤:
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR 反应液(TLH-qPCR MIX)、酶混合液(Enzymes MIX),冰上融化并振荡混匀后,10000rpm 离心10s。
设所需要的PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂 | 每个反应加入的量 | N个反应加入的量 | 荧光PCR反应液 | 14μL | N×14μL | 酶混合液 | 1μL | N×1μL | 总量 | 15μL | N×15μL |
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm 离心10s,向设定的N 个PCR 反应管中分别加入15μL 荧光PCR 反应液,向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(TLH-PTC)5μL,10000rpm 瞬时离心10 秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件:
| 1循环 | 50℃ for 2 min | 预变性 | 1循环 | 95℃ for 10 min | PCR扩增 | 40循环 | 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec |
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM。淬灭基团:NONE,请勿选择ROX参比荧光。
八、结果分析:
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。
8.2 试验成立判定
(1)阴性对照(NTC):不应产生任何的扩增曲线。
(2)阳性对照(TLH-PTC):均产生扩增曲线。
(3)以上条件应同时满足,否则,此次试验视为无效。
8.3 结果判定
(1)在试验成立的条件下,Ct值≤35的样本为阳性,表明副溶血性弧菌不耐热溶血毒素核酸阳性。
(2)Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明副溶血性弧菌不耐热溶血毒素核酸阴性。
(3)如果Ct值>35,判为可疑样品。对于可疑样品,先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线,则为可疑阳性,否则判为阴性。
(4)对于可疑阳性样品,重新抽提核酸,再次进行副溶血性弧菌不耐热溶血毒素qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线,判为样本阳性,表明副溶血性弧菌不耐热溶血毒素核酸阳性;否则判为样本阴性。
九、注意事项:
(1)初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2)所有使用的离心管应高压灭菌,而且必须不含DNA 酶。
(3)PCR 操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR 扩增区等),防止实验室污染。
(4)样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
(5)试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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![](http://item.yiqi.com/pic/ConPic/1/contentSYA070_02.jpg)
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名称:志贺氏菌单重荧光PCR检测试剂盒
货号:SYA003
规格:48次/盒
一、简介:
志贺氏菌属(Shigella)是一类革兰氏阴性杆菌,是人类细菌性痢疾zuì为常见的病原菌,通称痢疾杆菌。人类及其它动物对志贺氏菌易感,10-200个细菌即可致病。本方法为荧光PCR检测方法,反应在同一管内进行,操作简单,并有效防止了污染,能对样品中或预培养液中的志贺氏菌进行快速检测,具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。志贺氏菌的探针报告基团为FAM,淬灭基团为None。
二、用途:
该试剂盒适合于增菌培养物、疑似病料及食品中志贺氏菌的检测。
三、试剂盒组成:(50T/Kit)
组份 数量 规格
志贺氏菌荧光qPCR反应液(Shig-qPCR MIX) 1管 750μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(Shig-PTC) 1管 50μL/管
四、储存条件及有效期:
本试剂盒于-18℃以下保存,有效期为6个月。
五、荧光PCR仪器适用范围:
ABI系列,Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。
六、样品的采集与DNA提取
6.1 样品的采集
6.1.1 食品样品:样品采集与预培养参照《中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验(GB 4789.5-2012)》要求进行。
6.1.2 粪便样品:取粪便置于灭菌的收集管中送检。
6.1.3 病灶部位样品:取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
注:上述样品建议经过增菌后,收集培养物用于检测。
6.2 DNA提取(用户可根据需要选择商业化DNA提取试剂盒)
6.2.1 培养物:取培养物50μL(培养至一定浊度)或者挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
6.2.2 粪便样品:挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中,加入0.5mL生理盐水,振荡混匀,13000rpm离心3分钟,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
6.2.3 其他液体标本:取标本2-3mL,13000rpm离心3min,弃上清,沉淀中加入50μl DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
注:阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取),直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高,建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。
七、检测步骤:
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qPCR反应液(Shig-qPCR MIX),冰上融化并振荡混匀后,10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下:
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 15µL N×15µL
向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液,向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(Shig-PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM。
八、结果分析:
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。
8.2 试验成立判定
(1) 阴性对照(NTC):不应产生任何的扩增曲线。
(2) 阳性对照(Shig-PTC):均产生扩增曲线。
(3) 以上条件应同时满足,否则,此次试验视为无效。
8.3 结果判定
(1) 在试验成立的条件下,Ct值≤35的样本为阳性,表明Shig核酸阳性。
(2) Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明Shig核酸阴性。
(3) 如果35<Ct值≤40,判为可疑样品。对于可疑样品,先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线,则为可疑阳性,否则判为阴性。
(4) 对于可疑阳性样品,重新抽提核酸,再次进行Shig qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线,判为样本阳性,表明Shig核酸阳性;否则判为样本阴性。
九、注意事项:
(1) 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2) 所有使用的离心管zuì好高压灭菌,而且必须不含DNA酶。
(3) PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等),防止实验室污染。
(4) 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
(5) 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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