【前言】
本产品提供一个简便、灵敏、可靠地进行实时荧光定量PCR检测系统。产品已预混了经优化的反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、化学修饰热启动Taq酶(HotsTaq CG)和新型掺入荧光染料EvaGreen,制成2倍浓度的Master Mix,客户只需添加模板、引物,可用于以未标记引物进行的掺入法Real Time 定量PCR。
本产品使用的经改良的化学修饰热启动酶Hots Taq CG,热启动条件为95℃5分钟,为PCR反应提供了更高的产量及灵敏度、特异性、可靠性。
【规格】
200Reactions
【试剂组成】
2x HotsTaq qPCR Master Mix II 4×1.25ml
【用户自备的试剂、器材】
1.引物
试验前应准备好用于检测目的基因的引物对。引物应用HPLC或PAGE纯化。
2.实验用水
使用PCR用纯水。
3.待检样品
cDNA或基因组DNA
4. 参照染料ROX
5. RNasefree & DNasefree 的tip头,离心管,薄壁PCR管等
6. 各种规格的移液器
7.Realtime PCR仪
本产品适用于下列Realtime PCR仪:ABI PRISM®7700、ABI PRISM®7300、ABI PRISM®7000、MJOpticon 、BIORAD iCycler 、BioFlux公司的LineGene等的Realtime PCR仪。具体使用方法请参照相应仪器的说明书。
【PCR反应液配制】
反应液组份 | 加量 (μl) | 终浓度 | 备注 |
2x HotsTaq qPCR Master Mix II | 25 | 1× | |
上游引物 | 1 | 0.2μM | 用户提供 |
下游引物 | 1 | 0.2μM | 用户提供 |
待检样品 | 5 | 1~10ng | 用户提供 |
无菌去离子水 | 18 | - | 用户提供 |
总体积 | 50 | - | |
注:根据实际情况,引物浓度可在0.1~1μM范围内调整,扩增效率不高时,可适当增加引物的用量,但是引物太多,可能会导致非特异性增加。
【扩增条件】
以ABI7000为例,Detector设为「SYBR」、Quencher设为「None」。详细的设定请参照定量PCR仪说明书。
当引物Tm在60℃以上,建议使用:
95℃5分钟→95℃30秒→60℃1分钟
40个循环
当引物Tm在60℃以下,建议使用:
95℃5分钟→95℃ 30秒→55℃ 45秒→72℃1分钟
40个循环
注:以上扩增条件为实例,用户应根据引物的Tm 值及扩增片段的大小来确定适合的变性时间、退火温度,退火时间和循环次数,黑体字标识部分必须保留。
Real Time PCR一般不进行长片段的扩增,所以不需要对延伸时间进行调整。如果要调整,也务必确保data collection步骤至少30秒以上。
【保存条件】
本产品原则上在-20℃以下避光冷冻保存。如果在短期内需持续使用时,融解后可在4℃避光保存。
温馨提示:不可用于临床ZL。