甲基化PCR

 DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高度甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生。目前, 基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术，分为甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化测序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。

甲基化研究思路：寻找甲基化位点、验证甲基化位点，并进行甲基化程度分析、分析甲基化位点与研究的相关性、验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化。

1. 寻找甲基化位点
  1) 甲基化二代测序寻找甲基化位点；
  2) 对照组和实验组进行甲基化芯片检测，找到相关的甲基化位点；
  3) 一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，可预测该基因是否存在CpG岛；
  4) 根据文献寻找相关基因的甲基化位点。

2. 验证甲基化位点，并进行甲基化程度分析
  采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。
  1) MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；
  2) BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比；
  3) HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围；

  4）焦磷酸测序法： 验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比。

3. 分析甲基化位点与研究的相关性
  根据对照组和实验组样本的检测结果，分析与研究的相关性。
  1) 比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异；
  2) 比对对照组合实验组相同基因启动子区甲基化程度是否有差异；

4. 验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化
 采用荧光定量PCR的方法检测相关基因的表达量，如果表达量降低，可能由于启动子区发生甲基化导致的，从而影响该基因所在的某些通路，导致一些疾病，或表型发生变化；如果没有发生变化，可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切，从而不会影响基因的表达。

服务流程：

★ 根据目的基因启动子序列设计相应引物；

★ 基因组DNA的提取和定量；

★ 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA；

★ 修饰后DNA纯化回收；

★ a.结合实时定量PCR的qMSP；

  b.BSP，对PCR产物进行测序并与未经处理的序列比较；

★ 数据处理；

★ 向客户提交数据分析结果与实验报告。


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