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REPLI-g WTA Single Cell Kit (24)报价操作流程
基因分析往往需要大量的cDNA。全转录本扩增克服了RNA数量少的限制,可以对小数量的细胞甚至单个细胞进行分析。Z简单的反应设置,Z简单的反应设置,合理而简单的处理步骤,处理时间只需20分钟,完整的gDNA和RNA平行扩增总反应时间只有4小时,这使得REPLI-g Cell WGA & WTA Kit的操作步骤变得简单和可靠。
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit包含用于以下反应的试剂(参见REPLI-g WTA Single Cell Kit procedure):
细胞裂解:单一细胞样品(含有1-1000个细胞)在5分钟内有效地裂解,对RNA的完整性没有影响。裂解的样品用于总RNA的WTA,或可选的,富集mRNA(poly A+)RNA。
cDNA生产:细胞裂解后,在进行WTA前将gDNA去除,这是由于转录水平的精确测量依赖于消除gDNA污染所造成的假阳性结果。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物,所有的转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行总RNA富集)或只有多聚腺苷酸转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行poly A+ 富集mRNA)将会被扩增。因此,该反应将包含一个随机引物和寡核苷酸dT引物的混合物或只有寡核苷酸dT引物,这就减少了rRNA的扩增,并确保cDNA的3'末端反转录(转录物的大小大约是700–1000bp)。
连接反应:合成的cDNA通过一个GX率的连接反应进行连接。由于该连接反应的性质,cDNA段并未按照它们原本存在于细胞中的顺序组装。然而,这并不影响核酸序列的检测,如剪接区域,在下游应用中的进行NGS或qPCR。
全转录本扩增:连接的cDNA随后被扩增,利用MDA技术与新颖REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase,等温反应2小时。
根据研究需要,我们针对从单细胞扩增cDNA或纯化RNA提供了不同的实验方案:
“从单细胞扩增mRNA(poly A+)3'端区域”实验方案只扩增带有poly A +尾巴的mRNA(和其他的RNA),适合于广泛的应用,包括NGS(RNA-Seq)、real-time PCR和微阵列分析。
“从单细胞扩增总RNA”实验方案可扩增完整的转录本,包括带有和不带有poly A +尾的RNA,lnc RNA和linc RNA。需要注意的是,rRNA也将扩增并且扩增程度很高。如果用序列特异性探针(例如用qPCR或阵列协同工作),扩增的rRNA并不会影响下游应用的结果。如果将扩增的RNA用于RNA-Seq,请注意超过90%的片段来自于rRNA,因此进行全转录本测序时必须获得充足的读段。
“纯化RNA的扩增”实验方案针对从总RNA或富集RNA模板进行全转录本扩增的情况而优化,非常适合于大规模应用,包括NGS、real-time PCR和微阵列分析。