PCR的引物设计原则
答:①引物与模板的序列要紧密互补
②引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
③引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
一般原则:
1、引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-24 bp,但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大于16bp是必要的(不容易引起错配)。
2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。
3、引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。
4.、引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%
5、?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低(值不超过9),而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。(能值越高越容易结合)
6.、对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定
7.、引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。
3、如何使用GenBank获取数据: |
