一站式平末端克隆试剂盒基因片段用 Pfu 等 DNA 聚合酶扩增得到的产物为平末端，直接克隆比较困难。做 T/A 克隆时，需要在其末端添加单个碱基 A。本试剂盒提供了在平端添加单个 A 所需的所有试剂，大大方便后续的 T/A 克隆及序列分析
产品特点
一站式平末端克隆试剂盒产品及特点
基因片段用 Pfu 等 DNA 聚合酶扩增得到的产物为平末端，直接克隆比较困难。做
T/A 克隆时，需要在其末端添加单个碱基 A。本试剂盒提供了在平端添加单个 A 所需
的所有试剂，大大方便后续的 T/A 克隆及序列分析。其原理如下：
它具有下列特点：
1. 适用范围包括：由高保真 DNA 聚合酶如 Pfu、Pwo 、DeepVent 等扩增而来的
PCR 产物；一些限制性内切酶如 EcoRV 、SmaI 等酶切产生的 DNA 片段； 粘
端 DNA 用 DNA 聚合酶补平后的片段。
2. 可以在任何平末端 DNA 片段两端分别补上单个脱氧腺嘌呤 A，间接将 PCR 产物
克隆到 T 载体上。
3． 操作快速，5 分钟就可以完成 。
使用及效果
将 100 ng DNA ，加入 5µl 10 × Cloning Buffer， 加入无菌水使反应的总体
积为 50 µl，混匀。 72℃保温，5 分钟。产物回收或者 -20℃保存备用
本方法过程示意图如下：
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
使用方法 1. 取 1mL 过夜培养的细菌，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃上清，尽量吸干剩
余液体。如为冰冻保存的菌体沉淀可直接进行第 2 步。
2. 每 10mg 湿重菌体沉淀加入 0.5 mL 细菌蛋白微量提取溶液 A 和 50 uL 细
菌蛋白微量提取溶液 B，吹打混匀。
3. 冰上放置 30 分钟至 1 小时至菌液变清。
4. 4℃ 12,000 g 离心 1 分钟。
5. 将上清液转移至一新的 1.5 mL 塑料离心管中即得到蛋白溶液，可置于
-70℃冰箱保存或立即使用。如果要进行 SDS-PAGE 电泳，可取部分样品
到离心管中，加入 5×SDS-PAGE 上样缓冲液（终浓度为 1×），在沸水中
处理 5 分钟后立即上样电泳。
一站式平末端克隆试剂盒基于 Feinberg 和 Vogelstein 发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA 探针标记试剂盒，标记过程由双链 DNA 热变性、随机引物与单链 DNA 结合、在Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探针并掺入标记的核苷酸三步组成，
可用下面的示意图表示：
应用领域
一站式平末端克隆试剂盒对 Feinberg 和 Vogelstein 经典方法进行了改良，具有下列特点：
1. 提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了
标记反应的可重复性。
2. 使用无外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶，已标记 DNA 探针不会被酶降解。
3. 快速，Z快 1 小时即可完成标记反应。
4. 得到的 DNA 探针比活性高（如果是同位素，可以达到 109cpm/ug DNA）。
5. 所需模版 DNA 量少，可以是各种形状（线状和环状）的、也可以是单链或双链的，
但长度必须在 100 bp 以上。
6. 得到的探针长度在 200-400 nt 之间，可以用于 Southern 杂交、Northern 杂交、
原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7. 提供三种标记选择，其中 90603A 可用于各种同位素和非同位素标记，但需自备标
记底物；90603B 和 90603C 可分别用于生物素和标记，不需自备标记底物。
规格及成分 A 型
成 份 编 号 十孔盒包装
2×随机引物标记反应液(A 型) 90603a 50 uL
dATP，2 mM 90603d1 10 uL
dTTP，2 mM 90603d2 10 uL
dGTP，2 mM 90603d3 10 uL
dCTP，2 mM 90603d4 10 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 90603sc 1 份
B 型（生物素标记）
成 份 编 号 十孔盒包装包装
2×随机引物标记反应液(B 型) 90603b 50 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 90603sc 1 份
C 型（DIG 标记）
成 份 编 号 十孔盒包装包装
2×随机引物标记反应液(C 型) 90603c 50 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 90603sc 1 份
标本要求
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 0.5M EDTA（pH8.0）。如果是 A 型，则需要自备标记的核苷酸。
使用方法 1. 在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
成分 用量
模板 DNA 50-150 ng
2×随机引物标记反应液(ABC 三种之一) 10 uL
超纯水 补水到 15 uL
注意：非同位素标记基团疏水性强，易与塑料离心管表面非特异性结合，所以要硅化
塑料离心管。模板 DNA 并非越多越好，否则会竞争性地YZ探针跟靶分子的杂交。
2. 沸水浴 5-10 分钟，或在 PCR 仪上 100℃加热 5-10 分钟后立即放冰上待用。
3. 高速离心数秒使所有液体集中在管底，根据试剂盒类型加入下列成份：
试剂盒类型 成分及用量
A 型 dATP、dGTP、dCTP 各 1 uL（共 3uL，浓度均为 2mM）
自备的 2mM dTTP/标记 dUTP 混合物（见注）1uL
1 uL Klenow exo 聚合酶
B 型 1 uL Klenow exo 聚合酶
4 uL 超纯水
不需加 dNTP，已经包括在 2×随机引物标记反应液（B 型）中
C 型 1 uL Klenow exo 聚合酶
4 uL 超纯水
不需加 dNTP，已经包括在 2×随机引物标记反应液（C 型）中
注：上表中的 dTTP/标记 dUTP 混合物中 dTTP 和标记的 dUTP 的总浓度为 2mM，
dTTP 与标记 dUTP 的比例在 65：35 为。但如果使用自备的其他标记核苷酸，
如 fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin 和 aminoallyl 标记的 dUTP，则
用户需要自己摸索其与 dTTP 之间的比例，如果使用 32P 标记的 dUTP，则比
活Z好为 3000Ci/mmol，浓度为好为 10uCi/uL，并且不需要加入 dTTP。
4. 轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。
5. 37℃保温 1-20 小时。标记效率跟模板量和保温时间相关，具体见下表：
模版 DNA 用量
（ng）
1 小时后探针合成量
（ng）
20 小时后探针合成量
（ng）
10 80 900
30 150 1350
100 350 1650
300 750 2200
1000 1300 2600
3000 1600 2600
6. 加 1 uL 自备的 0.5M EDTA（pH 8.0）终止反应，加热 100℃ 5 分钟使 DNA 探
针变性成单链，然后直接加入到杂交反应液中即可。如果电泳检测，标记产物将是
弥散状态。立即放冰上待用或放-20℃保存一年。用前需要
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，
注意不要用酚抽提法纯化非同位素标记的 DNA 探针，因为这些标记分子疏水性强，
能使标记的 DNA 进入疏水的有机相而丢失，但可以用乙醇沉淀和 Sephadex G50
回收（可另购柱式探针纯化试剂盒，产品编号 121122）。对比活高的同位素标记探
针，由于同位素其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。
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