上海拜沃以质量为本,树立“拜沃质量”是公司的发展目标。我们一直加倍努力,竭尽全力做到不辜负您的支持与信赖。同时公司也离不开广大客户的帮助支持,真诚邀请国内外有实力的实验室、生物技术公司合作,共同发展。目前拜沃提供的服务范围包括:生物合成siRNA、shRNA的制备;转录编码shRNA的DNAs、转录编码shRNA的质粒载体订购;siRNA靶位的设计和实验选择分析;siRNA相关试剂和RNA技术相关产品的代理销售;重组病毒构建包装;基因蛋白表达、载体构建、多克隆抗体和单克隆抗体制备;多种细胞学服务;常用的分子生物学试剂、实验仪器、实验耗材销售等。 拜沃在分子生物学和免疫学实验技术,特别抗体制备技术方面同样具有丰富经验,提供快速、优质、性价比高的实验服务。
载体构建技术服务
拜沃生物 siRNA载体构建服务程序:
1. siRNA表达载体的选用:
本公司选用的siRNA表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记,可以建立稳定表达系,同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。载体中还含有Amp 抗性基因,可以无限扩增。
2. 设计siRNA 靶序列
A、根据目的mRNA序列,设计3 条RNA干扰靶序列,靶序列一般为19-21nt长。
B、对于每条选定的siRNA靶序列,设计siRNA正义链和反义链,以loop(9nt)相连,称为shRNA(short hairpin RNA)。
3. 合成模板:
合成每条编码shRNA的DNA 模板的两条单链,退火DNA 单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点,同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点,可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI 和 HindIII酶切位点之间。
4. siRNA空载体用BamHI 和 HindIII双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳,回收线性载体。
5. 连接与转化:
把退火的DNA 模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶,插入片断与载体的摩尔比约为3:1。连接产物转化DH5α 大肠杆菌,在LB Amp培养基上涂板,37℃培养过夜。
6. PCR鉴定:
挑取转化的菌落PCR,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定具有shRNA编码序列的阳性克隆(图例)。
7.测序鉴定:
对PCR鉴定阳性的克隆再进行测序鉴定,确定shRNA编码框架和模板序列正确无误(图例)。
8. 柱抽提阳性克隆载体并定量。
siRNA 序列的siRNA™试剂盒包括:
√ 3条编码shRNA的载体(各10µg),保证其中一条siRNA 序列的有效.
√ 1条编码阴性对照shRNA的载体(10µg)
采用的阴性对照是通用序列,在人和小鼠的基因组中都没有同源位点;
√ 大肠杆菌DH5α菌株
√ siRNA载体的构建、鉴定记录及使用说明。
详情请登入:www.biovol.net