GXT载体PCR克隆试剂盒(ccdB T-vector PCR Cloning Kit)
产品概述
在PCR过程中,Taq酶会在PCR产物的3'末端加上一个A,利用这个特点采用T载体可以方便地克隆PCR产物。本产品用pEcoRV Vector作为克隆的T载体,该载体在E.coli自杀基因ccdB(Control of cell death)的上游启动子内引入一个EcoRV位点,并且加上T。如果自连产物转化E.coli后,ccdB基因则会表达,表达蛋白会破坏细菌的DNA gyrase,造成细菌染色体的降解导致细菌死亡(阴性克隆);载体插入外部片段的时候,破坏了ccdB的读码框,使载体能在E.coli中扩增(阳性克隆)。这样避免了蓝白斑筛选等繁琐工作,使PCR产物克隆简单快速。
用途
- Taq酶的PCR产物克隆
- 用于taq酶PCR产物的测序(M13+primer)
储存条件
冰袋运输;长期保存-20℃(12个月以上);10x T4 DNA ligase Buffer 中含 ATP,为避免ATP的降解,建议解冻后的10x T4 DNA Ligase Buffer 分装成小包装并在-20℃保存。
产品特点
- pEcoRV-T载体自连产物转化大肠杆菌,大肠杆菌菌落<5个/10平板。
- pEcoRV-T载体和Control insert连接转化大肠杆菌,大肠杆菌菌落>1000个/平板。
试剂盒组成
T4 DNA Ligase | 10x T4 DNA Ligase Buffer | pEcoRV-T vector | Control insert |
10 U/µL | 400 mM Tris-HCl,pH 7.6 100 mM MgCl2,100 mM DTT 5 mM ATP | 20ng/µl | 20ng/µl |
使用示例
- 以 10μl 连接体系示例,在微量离心管中加入以下各种成分:
试剂 | 使用量 |
pEcoRV-T Vector(20ng/µl) | 10ng |
Insert DNA | 3:1 to 10:1 (molar ratio over vector) |
10X T4 DNA Ligase Buffer | 1µl |
T4 DNA Ligase(10U/µL) | 1µl |
ddH2O | Up to 10µl |
- 16℃反应30min;
- 室温(25℃)也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低
- 保温5min也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低
- PCR产物(2Kb以上)进行DNA克隆时,连接反应时间请延长至数小时
- 连接产物(10µl)加入100µl DH5a(或者*0)感受态细胞中,冰中放置30min;
- 42℃加热45秒后,再在冰中放置2min;
- 加入500µl LB培养基,37℃培养30min;
- 在含有Kan+的LB琼脂平板培养基上培养,37℃过夜,形成单菌落,计数;
- 挑选菌落,用PCR方法确认插入片段的长度。
克隆结果示例
Control Insert | 连接/转化效率(cfu/ug Vector) | 阳性菌落比率 | 效率(%)* |
1 | 5.0 x 107 | 98.5 | 98以上 |
2 | 5.0 x 107 | 97.0 | 95以上 |
* 效率值菌落中的目的DNA insert片段的连入效率。注意事项
- 连接酶:
- T4 DNA连接酶要求Mg2+,因此螯合Mg2+的EDTA的存在会阻碍反应;
- NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈YZT4 DNA Ligase;
- 65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟可以导致T4 DNA Ligase失活;
- 聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率。
- 插入片段:
- 如果Insert DNA 太小(<100bp),不能够完全破坏ccdB的启动子,将造成筛选失败;
- Insert DNA应该是taq酶(货号T004)扩增、胶回收纯化处理后才进行载体连接,尽量避免其他杂带的存在;
- PCR产物(2Kb以上)进行DNA克隆时,连接反应时间请延长至数小时。
- 感受态细胞的选择:
- 转化时请使用GX的热转化感受态细胞(转化效率≥1X108cfu/µg pUC19),这样才可能得到比较理想的阳性克隆。
- 克隆产品测序引物:M13 reverse primer, M13(-40) forward primer (见附图)
pEcoRV T-Vector 载体结构图:
产品规格
货号 | 规格 | 包装规格 |
T4 DNA Ligase(10U/µL) | 10X buffer | pEcoRV Vector(20ng/µl) | Control insert(20 ng/µl) |
MCK002-20 | 20T | 40 µl | 200 µl | 25µL | 20µL |
MCK002-100 | 100T | 200 µl | 1 ml | 125µL | 100µL |
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产品货号 | T004-S | T004-M | T004-L |
产品规格 | 500U | 2000U | 10000U |
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