平末端载体连接试剂盒（含多克隆位点）

特别提示：包括平末端载体连接试剂盒（含多克隆位点）(T4连接酶技术)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：平末端载体连接试剂盒（含多克隆位点）(T4连接酶技术)
英文名称：Zero background flat end fast connection kit(with mcs)
产品货号：ALH339
产品规格：20次|40次

本试剂盒是一种先进的自杀基因阳性选择克隆系统，可以GX克隆平末端PCR产物和任何具有平末端的DNA片段。该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的 DNA片段都有效。 阳性选择载体和插入片段连接仅需5分钟即可获得超过95%的阳性重组克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）扩增的平末端 PCR 产物可直接连入克隆载体。连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。

试剂盒提供一个新颖的自杀基因阳性选择克隆载体t。该载体含有致死的自杀基因（内含多克隆位点），当载体与片段连接成功，自杀基因无法正确表达，包含重组子的细胞可以正常生长；当载体与片段连接不成功，载体自连后自杀基因正确表达，包含自连空载体的细胞无法存活，即“零ZERO”背景。这种阳性筛选策略无需蓝白斑筛选，极大地加速了克隆筛选进程。

为方便酶切作图和插入片段基因操作，本试剂盒克隆载体的多克隆位点两侧各包含一个BglII识别序列。此外，该载体含有T7启动子，可用于体内或体外转录、插入片段测序等研究。

试剂盒组份(20次)：
平末端载体(40ng/μl)——————————————20μl
900bp Control（40ng/μl）————————————5μl
2×Quick Ligation Buffer-————————————100μl
T4 DNA ligase（5U/μl）—————————————20μl
Forward Sequencing Primer (10μM)————————50μl
Reverse Sequencing Primer (10μM)————————50μl
注：
forward sequencing primer, 23-mer 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’
reverse sequencing primer, 24-mer 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’

储存条件：-20℃，有效期6个月。

本制品别名：平末端克隆试剂盒

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名称：大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞
货号：BTN90505
规格：0.1mL*10
本产品是大肠杆菌BL21(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。使用pUC19质粒检测本产品，转化效率可达107。BL21(DE3)菌株适合表达非毒性蛋白。
该感受态细胞用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的GX外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3 区的lacUV5启动子，该区域整合于BL21的染色体上。
菌株基因型为：F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC或LB培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以50μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA 所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3. 42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4. 每个离心管中加入450μl 无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

注意事项：
1. 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4,000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2. 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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