特别提示:包括一步法microRNA反转录试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床YL及其他非科研用途!
产品名称:一步法microRNA反转录试剂盒
英文名称:One Step microRNA cDNA Synthesis Kit
产品货号:MT0005
产品规格:25T|100T
由于miRNA(microRNA)分子序列较小,仅20nt左右,没有真核生物特有的Poly(A)尾巴结构,采用传统Oligo dT引物和随机引物很难获得从miRNA到cDNA的反转录产物。目前普遍采用的解决方案有两种:特异性反转录引物(下图A所示)、两步加A法反转录方案(下图B所示)。Biorab公司开发出一套全新的一步法miRNA反转录试剂盒,可以对成熟的miRNA同时完成Poly(A)反应和反转录反应,直接获得含有特异性tag和15(T)的cDNA产物(下图C所示)。该方法使得miRNA反转录与mRNA的反转录一样轻松,直接将提取的microRNA与反应缓冲液混合物混合并置于PCR仪上1小时即可获得高浓度的、包含所有miRNA分子的cDNA产物,获得的cDNA产物适合于采用SYBR Green染料法进行RealTime PCR进行定量检测。
产品组成: 组分 | MT000(25T) | MT0005B(100T) |
4×One step miRNA RT Solution | 125μl | 500μl |
10×miRNA RT Primer | 50μl | 200μl |
RNase Free H2O | 1ml | 1ml×2 |
储存:请置于-20℃,可保存2年,避免反复冻融。
注:如4×One step miRNA RT Solution出现沉淀属正常现象,可用手捂化,混合均匀后使用不影响实验结果。
特别说明:10×miRNA RT Primer引物为5"-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3",定量扩增用特异性上下游引物进行扩增,下图2是以hsa-miR-21为实例说明特异性上下游引物的设计方法(Biorab的microRNA荧光定量PCR试剂盒提供所有miRNA检测,货号:MTAXXXXX,所有引物均经过设计优化,详细请于引物列表中查询。如果您研究的miRNA分子不在列表中,请来信咨询,我们将及时给您优化设计)。
图1:技术原理图:
图2:hsa-miR-21实例设计原理:
操作方法:1.按以下组分配制反转录反应液:
模板 | miRNA | 0.01-0.1μg |
Total RNA | 0.1-2μg |
4×One step miRNA RT Solution | 5μl |
10×miRNA RT Primer | 2μl |
Rnase-Free H2O | Up to 20μl |
2.在PCR仪上按以下条件进行反应:
37℃——————60min
95℃——————5分钟
3.获得cDNA产物后使用microRNA荧光定量PCR试剂盒进行miRNA定量检测。使用该试剂盒反转录所得cDNA产物包含了样品中所有miRNA反转录产物,可用于多个基因的检测分析,可使用内参基因进行定量矫正。内参基因可选择使用RNU6B miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号:MTA01501),适用于来源于人和鼠等哺乳动物的样品;RNU44 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号:MTA01502)、RNU48 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号:MTA01503),适用于来源于人的样品;SnoRNA135 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号:MTA01504)、SnoRNA202 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号:MTA01505)适用于来源于鼠的样品。Biorab提供的内参扩增引物浓度均为10μM,每20μl反应体系中加入0.4-0.8μl。
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温馨提示:不可用于临床ZL。