DIA技术 蛋白质组学研究 蛋白定量分析

DIA相比于DDA的的优势在于GX测定复杂样品中丰度极低的蛋白分子，极大地提高了定量分析的可信度。其原理是在质谱数据采集时，高速、循环的将每个采集窗口内的所有母离子及其子离子碎裂后进行全扫描，而非根据母离子信号强度筛选后进行二级碎片再扫描^{[1, 2]}。因此DIA具有高通量、高分辨率、高可重现性、定量准确等优点，而且样本无需分级上机，极大的缩短了每个样品的检测时间，适合大样本量的蛋白质组研究。但由于DIA获得的是几乎没有任何丢失的所有离子信息，数据量及其复杂性大大增加，数据分析难度加大。目前主流的数据分析是基于 DDA/DIA 构建的谱库和实验产生的 数据对样品中的蛋白质进行鉴定和定量。公共的谱库可以从各大蛋白质组研究数据平台下载，但对于一些特异性的样本，为了有更好的鉴定结果，还需要通过实验样本建立DDA参考数据库。

数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一，一度引领了定量蛋白质组学新发展。

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提取的蛋白酶解之后，利用液质联用技术对肽段进行质谱分析，通过比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。每条肽段的丰度（量）与其在质谱中的峰面积或信号强度成正比；而不同样品的同一条肽段在LC上的保留时间（retention time， RT）是一致的，因此，可以通过对比谱图库中的信息，再整合到相应蛋白，实现对蛋白质在不同样本中的相对表达水平的定量分析^{[1, 2]}。

（1）重现性好：采集所有离子及碎片谱图，不丢失任何信息；

（2）选择性好：基于碎片离子（即母子离子对）定量，与 SRM/MRM 相当；

（3）准确度高：循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高；

（4）通量高：同时监测所有目标蛋白/ 化合物，通量无上限；

（5）时效性强：对于易降解样品可以即刻采集，获得数据后再深入挖掘；

（6）数据易追溯：即使目前的水平无法发现某些蛋白/化合物，未来可以回溯

临床疾病标志物的筛选

作用机制研究

药物作用靶点研究

疾病的分子分型

磷酸化靶点研究

癌症血清标志物的筛选与验证

（1）从样本中提取蛋白并用BCA法或Brandford法进行蛋白的浓度测定；

（2）SDS-PAGE检测蛋白质完整度；

（3）每个样品取等量蛋白质进行酶解；

（4）对酶解后的肽段使用反向色谱柱，进行组分分离；

（5）加入混合标肽段（保留时间校正）；

（6）酶解后的多肽进行DDA建库，并对DDA建立库数据整理。。

（5）使用DIA模板，进行液相色谱串联高分辨质谱（LC-Orbitrap MS）采集，获得高质量DIA数据。

（6）对DIA数据进行处理，得到可信蛋白、筛选差异表达蛋白、差异蛋白生物信息学分析。

图 DIA操作流程

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小鹿智囊

① DIA技术有什么优势？

答：肽段覆盖率高、定量准确度高、实验重复性好；DIA技术的蛋白定量是基于二级质谱定量，相对于传统的Labelfree技术来说定量准确度更高；对比ITRAQ/TMT技术，DIA技术没有通量限制，可以同时对大样本量样品进行定性定量比较；DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测；DIA技术不需要昂贵的标记试剂，同时克服了标记效率对定量的影响；

② DIA技术需要做技术重复么？ 

答：DIA技术需要至少三次生物学重复，特别是临床样本，重复越多越好。

③DIA技术为什么需要重新建库，NCBI和uniport的数据库不能用么？

答：DIA本身是一种扫描的方式，我们常用的技术比如itraq/TMT、Labelfree等都是基于DDA的扫描方式，而且目前的数据库也只适合DDA扫描的出来的质谱数据，所以我们只能人工的建立一个数据库，才能供DIA的数据进行识别。

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