Digoxin随引物标记和检测试剂盒Ⅰ(POD)批发

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北京百奥莱博专业生产销*(代"售")Digoxin随引物标记和检测试剂盒Ⅰ(POD)批发，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：Digoxin随引物标记和检测试剂盒Ⅰ(POD)批发
编号：ZN1518
规格：1盒
品Pai：百奥莱博
产地：北京
保存条件：-20℃冰冻保存。
保存期：一年
用途：用于DNA探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。
工作量：可用于标记0.1—3μg的探针6次及1000张切片的原位杂交或12次10×10cm膜上杂交检测。
原理：
所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核苷酸(hexanucleotide)作为引物，
dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入Digoxin的DNA链。以Digoxin标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来
进行检测。一般通过酶标抗Digoxin抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。特点：
(1)标记属GX标记反应。以1μg DNA探针为例，1小时反应即可产生0.8μg标记探针，20小时可产生2μg左右的标记探针。
(2)试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。
(3)标记反应适于下述对象：
a.DNA从10ng—3μg。
b.不等的DNA长度100bp—10kb。
c.线形排列或呈高度卷曲之DNA。
d.低融点琼脂中的DNA。
(4)检测系统抗体为抗Digoxin单抗+SABC。抗Digoxin单抗标记生物素，效价1：1000-2000(膜上杂交)或1：1000(原位杂交)。
(5)显色剂为DAB，非常稳定。用时1：40稀释。
(6)试剂盒敏感性达到0.1pg，足够检测出1μg基因组DNA中的单个基因。
(7)除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。
操作程序 ：
一随机引物标记操作程序如下：
①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。
②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
③加4μl DIG Random Labeling Mix(GX),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。
④置37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加Digoxin标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。
⑤加入2μ 1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。
二核酸探针膜上杂交原理和操作
(一)杂交总原则
脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使*键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。
(二)杂交膜的选择
杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸5-10分钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。
(三)探针浓度
探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。
所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移DNA的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不同浓度的探针可以参考下述方法配制：取5μl标记反应液加1ml探针稀释液，混匀。取0.5ml等倍释后，再取0.5ml继续等倍稀释。假设20μl标记反应液中含1μg标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。
(四)预杂交和杂交液
预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配方：
①Standard buffer：5×SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
②Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%(w/v)SDS,2% Blocking Reagent。
③High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5 ×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodiμm Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
(五)Southern Blotting 
DNA片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。
Southern印迹杂交包括两个主要步骤①把电泳分级的DNA转移到固相支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。
1．Southern转移
首先将DNA用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经*化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。
试剂
a.0.25M HC1
b.变性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1
c.中和度：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1
d.20×SSC：0.3M柠檬酸*,3M Nac1
e.2×SSC：0.03M柠檬酸*,0.3M Nac1
程序：
(1)将胶浸入0.25M HC1中10分钟。HC1处理的作用主要是通过去嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略此步骤。
(2)进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。
(3)把胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。
(4)蒸馏水漂洗凝胶2次。
(5)把胶浸入中和液中，室温泡15分钟×2次。
(6)在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用2×SSC浸泡。
剪两张Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。
(7)准备转移用平器和支架，平器中放20×SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。
(8)依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500-1000g)
注意：要检查PH值，用硝纤膜时PH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的DNA难以被吸到硝酸纤维膜上。
(9)于室温转移12-20小时。
(10)取出转移膜，用2×SSC漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。
(11)固定：可选择下述方法之一进行DNA固定
·紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20分钟，简单漂洗后干燥备用。
·尼龙膜置+120℃烘烤30分钟。
·硝纤膜置真空烤箱中，80℃减压烘烤2-2.5小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱，亦可在普通烤箱中65-70℃烘烤3-4小时，也能达到固定目的。固定后，将膜封于塑料袋中，保存于干燥处待杂交。
注意事项①转移液的盐浓度对转移具有一定影响。应选择20×SSC快。10×SSC转移速度较快，对于高分子量DNA(〉10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转移液。
②转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。
③硝酸纤维膜对于0.5kb以下的小分子DNA结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片时Z好用尼龙膜。
2 ．Southern印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5-25ng/ml，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。
试剂
a.Standard buffer
b.Standard buffer+50% formamide
c.High SDS buffer
d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS
e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS
程序
①将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留2-4mm空隙。灌注杂交液的一边留1cm空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。
②根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交4-20小时：Standard buffer:预杂交温度65-68℃，Standard buffer+50% formamide:37-42℃，High SDS buffer:37-42℃。
③使用双链DNA探针时，沸水浴10分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。
按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度5-25ng/ml。按每100cm2膜加入至少3.5ml配制杂交液。
④使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。
⑤杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃10分钟以变性探针。杂交液如含有50%甲酰胺，则在68℃变性10分钟即可。
⑥取出杂交膜，用Wash Solution I洗5分钟×3次。
⑦保温冲洗：用Wash SolutionⅡ于68℃冲洗15分钟×2次。
(六)· DNA Dot Blotting 
此检测方法用于快速定性筛选DNA。样品可以是纯化DNA，也可以是细胞碎片PCR扩的DNA。预杂交和杂交方法与Southern基本一致，不同的仅是样品的处理不同。
试剂：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring Sperm DNA
程序
①将样本DNA稀释成不同浓度。
②将样本DNA于+95℃水浴10分钟，迅速插入冰中。
③取1μl点样至尼龙膜或硝纤膜上。点样前先画上圆卷做记号。
④用紫外线照射固定或+120℃烘烤30分钟固定。
其后杂交步骤Southern相同
(七)DAB显色检测法
试剂：
a．.Biotin—Mouse Anti—Digoxin 200μl
b．SABC—POD 200μl
c．DAB Stock Solution 5ml
d.冲洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1,PH7.4。
e.封闭液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。
f.显色缓冲液：0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4。
g.TE缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0
程序：
1．经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。
2．用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭60分钟。
3．用冲洗液冲洗5分钟×3次，每次100ml 。
4．用封闭液(e)1：1000-2000稀释Biotin—Mouse Anti—Digoxin，例如10μl Biotin—Mouse Anti—Digoxin加至10-20ml封闭液中(稀释液+4℃可稳定24小时左右)。将适量稀释抗体加入杂交袋中37℃反应1-2小时。
5．用冲洗液冲洗5分钟×3次，每次100ml 。
6．用封闭液(e)1：1000-2000稀释SABC，例如10μl SABC加至10-20ml封闭液中(稀释液+4℃可稳定24小时左右)。将适量稀释SABC加入杂交袋中37℃反应1-2小时。
7．用冲洗液冲洗15分钟×3次，每次100ml。
8．按1：40配制底物显色液：250μl储备液加至10ml显色缓冲液中，用前加浓度为0.03%的H2O2，室温显色5—30分钟左右。当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录。还有一种选择是让膜干燥保存。
三原位杂交
所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在DNA、mRNA水平的表达。
原位杂交技术Pardue and Gall和John etal。分别在1969年发现。Z初，放射性标记技术是WY的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简单、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。
(一)染色体原位杂交的一般技术
1玻片准备
为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖*酸或APES处理玻片。
2固定
为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇/乙酸固定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用固定。冰冻切片采用4%甲醛或Bouin"s固定液固定30分钟。应予注意的是，DNA和RNA虽然不和各种交联剂反应。但包围DNA.RNA的各种蛋白质和交联剂反应后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必须采取各种增加通透性的程序。
3玻片上材料的预处理
a．内源性酶的灭活
如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用1%H2O2/甲醇30分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，残余碱性磷酸酶的活力会完全消失。
b.RNA酶的处理—DNA-DNA杂交时需要处理内源性RNA。
内源性RNA的存在，会由于DNA-RNA的杂交而增加背景。处理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分钟。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodiμm Citrate,PH7.4)
c.HC1处理用200mM HC1处理20-30分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。可能与蛋白的抽提和部分功能核苷酸片断的溶解有关。
d.去垢剂处理
在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如Triton X-100,Sodiμm dodecyl Sulfate等，同样有助于原位杂交技术。
e.蛋白酶消化
蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分钟。蛋白酶K浓度依不同对象来确定。
例如对染色体和核的分离部分，可以用1μg/ml蛋白酶K。
4探针和靶基因的变性
对染色体DNA的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到的变性条件。
热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到80℃，2分钟后取出冷却至37℃。如果是组织切片，变性时间应达到80℃10分钟。组织和细胞mRNA的杂交则不需变性处理。
5杂交后的冲洗
标记探针能够和其序列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针，而保留特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常用2×SSC＋50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大)。
6免疫细胞化学
免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非特异性的封闭处理。如探针为Digoxin标记时，Tris-HC1缓冲液含“Blocking Reagent”。此外0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。免疫细胞化学中Z常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用DAB作显色剂。后者用BCIP/NBT作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下控制。
7影响原位杂交的主要因素
a.探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。不同的杂交所允许的Z小核苷酸如下述公式所计算：
b.探针浓度：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选择可接受背景的探针浓度。
c.硫*(代"酸")萄聚糖：在水溶液中，硫*(代"酸")萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子(如探针)难以接触到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。
d.碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止探针与靶基因的非特异结合。
e.冲洗条件
8杂交标准条件
适于DNA探针〉100bp
⊙50%去离子甲酰胺
⊙2×SSC
⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,PH7.0
⊙1mM EDTA
⊙载体DNA
任选组合：
1×Denhardt`s
dextran sulfate,1-10%
温度37-42℃
杂交时间：5-16小时
(二)组织切片的原位杂交
目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病毒，癌基因，基因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的实验室广泛应用原位杂交创造了条件。对固定、石蜡包埋切片的原位杂交，关键是以下三个步骤：
①靶DNA的暴露。这要靠精心设计的消化步骤。
②DNA的变性和杂交。
③杂交的分子的冲洗和检测。
1探针的准备
2玻片的处理
①去污剂浸泡一晚，大量自来水冲洗，然后用蒸留水清洗。
②干燥之后，浸入丙*(代"酮")中3分钟。
③玻片移入1：50丙*(代"酮")稀释的APES溶液中，浸泡5分钟。
④玻片用蒸馏水略加清洗。干燥备用。处理后的玻片置干燥无尘环境可保存半年。玻片也可用“多聚赖*酸”处理。
3组织切片的准备
①组织用常规4%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋。
②常规切片。切片捞于涂有粘片剂的玻片上。
③切片处理：先置60℃烘片30分钟。
二甲*脱蜡，逐级酒精至水清洗。
④临用前配制蛋白酶K溶液：
储备液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。将储备液用TES稀释成100μg/ml。
(TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4)
⑤每张切片用Proteinase k 20-30μl 37℃消化5-15分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片，并置湿盒中。注意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消失殆尽，消化不足则敏感性不够，因此应针对不同组织尝试不同的消化条件。
4杂交
①蛋白K消化后，去除盖玻片。用4%甲醛4℃固定5分钟。
②蒸馏水洗5分钟。
③让切片上水分滴下去，并在室温干燥5分钟。注意只能让切片上水份减少，不能让切片完全干燥。④每张切片加5-10μl探针(大切片需相应增加)。
⑤设立严格的对照组，每张切片加5-10μl不加探针的杂交液。
⑥切片上加硅化盖玻片，将玻片置+95℃变性6分钟。
⑦把玻片放到冰上1分钟。
⑧切片置温盒，42℃杂交3小时以上。如果方便，应杂交过夜。
5冲洗
去掉盖玻片，按下述程序冲洗
2×SSC洗5分钟×2次(室温)
0．1×SSC洗10分钟(42℃)
6杂交分子的免疫检测
①切片置于0．1M TBS缓冲液中，PH7．4
②每张切片加20-40μl封闭液：1%Blocking Reagont/0.1M TBS。室温反应15分钟。
③用封闭液1：1000稀释Biotin—Mouse Anti—Digoxin ,每张切片加20-50μl稀释试剂，湿盒室温反应1-2小时。用0．1M TBS洗5分钟×3次。
④用封闭液1：1000稀释SABC，37℃反应60分钟。0．1M TBS洗10分钟×3次。
⑤配显色剂：将DAB储备液用0．1M PBS，PH7．5缓冲液1：20稀释。加为0.03%H2O2。
每张切片加50μl，一般显色5-30分钟。信号弱时显色延长。
(三)细胞的原位杂交
下面的程序是用标记DNA探针来检测培养细胞中的mRNA。其它类型的检测可以参照此程序进行。1细胞准备，固定和增加通透性注意：所有溶液都必须用RNaseYZ剂处理。
①玻片用多聚赖*酸处理。直接用5% CO2在玻片上培养细胞。所用培养基为无酚红Dulbecco"s基础培养基。
②37℃PBS清洗细胞。然后用下述固定液室温固定30分钟：4%甲醛，5%乙酸和0．9%NaC1。
③室温PBS清洗固定细胞，用70%乙醇储存于4℃
④杂交前用下述方法脱水：70%，90%和乙醇；10%二甲*；然后再用，90%，70%乙醇，PBS洗二次。
⑤用胃蛋白酶消化固定细胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分钟。
⑥PBS洗5分钟后，1%甲醛固定10分钟。PBS洗。
其余步骤参照组织切片程序实行。

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·PP2A mRNA原位杂交试剂盒
编号：ZN1161
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液2ml；
3.PP2A mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液2ml；
4.封闭液5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：Z重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以YZRNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
PP2A的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。


Digoxin随引物标记和检测试剂盒Ⅰ(POD)批发关键词：Digoxin随引物标记和检测试剂盒Ⅰ(POD),百奥莱博,ZN1518


·Annexin A1 mRNA原位杂交试剂盒
编号：ZN0063
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：mouse,human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液2ml；
3.Annexin A1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液2ml；
4.封闭液5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：Z重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以YZRNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
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Annexin的细胞胞浆着色呈棕黄色。
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由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。


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