重组逆转录病毒载体转染试剂盒产品说明书

重组逆转录病毒载体转染试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

重组逆转录病毒载体转染试剂是一种旨在通过强烈的阳离子脂质体介导载体，帮助重组的目标逆转录病毒载体DNA轻易通过单嗜性病毒包装细胞的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于重组逆转录病毒载体DNA（例如莫罗尼氏鼠白血病病毒（MoMuLV）等）转入单嗜性病毒包装培养细胞系（例如人胚肾Bosc23细胞等）。可以被用于稳定转染或暂态转染。产品严格无菌，即到即用，无核酶污染，配比优化，操作简捷，性能稳定，转染效率达80至100％。

技术背景

LipofusinX由磷脂形成稳定的微囊，其带有强负电性的精胺基团，与阴离子DNA形成复合物，与细胞表面带负电荷的受体结合，通过内吞作用进入细胞，促进极性分子穿透细胞膜，具有的穿膜能力。血清干扰因素无损于携带外源性DNAGX进入细胞内。逆转录病毒是正链RNA病毒，其基因组中有编码反转录酶和整合酶（integrase）的基因，在这些酶的作用下病毒基因组RNA被逆转录成双链DNA，然后随机整合在宿主细胞的染色体DNA上，并长期存在于宿主细胞基因组中。

在构建逆转录病毒载体时，由于大部分病毒的必需基因和包装信号被ZL基因取代，这样产生的重组逆转录病毒不能表达病毒结构蛋白，因此这种病毒载体已无能力复制和包装成成熟的病毒颗粒。重组的已插入外源基因的逆转录病毒载体必须先在体外一个经过特殊改造和修饰的临时性细胞（Packaging cell）中复制并包装，成为含有外源基因的具有感染能力的病毒颗粒。

产品内容

清理液（Reagent A）                   40毫升

转染液（Reagent B）                  100微升

强化液（Reagent C）                  100微升

产品说明书                                             1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

重组质粒DNA：用于转染的目标DNA

病毒包装细胞（例如Bosc23细胞）：用于目标DNA转染的宿主细胞

1.5毫升离心管：用于转染液和DNA操作的容器

15毫升锥形离心管：用于病毒悬液操作的容器

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（12052）：用于转染后的细胞培养

实验步骤

转染实验开始前，移取230微升清理液（Reagent A）到无菌的1.5毫升离心管，然后加入10微升转染液（Reagent B），再加入10微升强化液（Reagent C），用1000微升枪头轻轻上下抽吸混匀，成为转染工作液。然后进行下列操作。

• 准备1个25cm²细胞培养瓶（2.7 X 10⁶细胞）的病毒包装细胞（例如Bosc23细胞等）
• 转染前24小时，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脱离细胞一次（注意：此步骤重要）
• 重新铺板到新的25cm²细胞培养瓶（注意：确保细胞完全均匀分离，避免形成细胞团快。此步骤重要）
• 转染前细胞生长达到80％铺满率（注意：此步骤重要）
• 小心抽去细胞培养液
• 加入2毫升37℃预热的清理液（Reagent A），铺满细胞生长表面，等待转染
• 移取230微升清理液（Reagent A）到无菌的1.5毫升离心管
• 加入20微升用户需转染的重组逆转录病毒载体DNA（总量3微克），用1000微升枪头轻轻上下抽吸混匀
• 用1000微升枪头一滴一滴缓慢加入DNA混匀物到上述配制的转染工作液里，再用枪头轻轻上下抽吸混匀
• 混匀后，在室温下静置15分钟，期间轻轻混匀数次
• 小心抽掉细胞培养瓶里的清理液（Reagent A）
• 轻轻加入1毫升清理液（Reagent A）到培养瓶里，铺满细胞生长表面
• 轻轻混匀含有DNA的转染工作液，即刻轻轻缓慢加入所有500微升到细胞培养瓶里
• 轻轻摇动细胞培养瓶，使其混匀
• 放进37℃细胞培养箱，孵育3小时（注意：参见注意事项9）
• 小心抽掉含有转染液的培养液（注意：参见注意事项10和11）
• 加入5毫升用户自备的完全细胞培养液
• 放进37℃细胞培养箱，孵育24小时
• 小心抽掉细胞培养液
• 加入2.5毫升用户自备的完全细胞培养液
• 放进37℃细胞培养箱，继续孵育24小时（注意：如果细胞生长铺满率低于95％，增加培养24小时）
• 移取2.5毫升细胞培养液到15毫升锥形离心管（如果载体携带beta－gal报告基因，贴壁细胞可以进行beta－gal染色，确定转染效率；通常转染效率达80至100％）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为500g（去除活细胞）
• 或进行针筒过滤器（0.45微米过滤膜）过滤
• 小心移取2.3毫升上清液分装到2个1.5毫升离心管
• 放进－70℃冰箱里保存
• 或置于冰槽里即刻进行后续感染双嗜性病毒包装培养细胞系（例如PA317细胞等）

注意事项

• 本产品为10次操作
• 整个操作须无菌操作
• 操作时，须戴手套
• 注意病毒操作安全
• 操作时使用的枪头须使用带滤芯的枪头
• 建议使用高度纯化且无内毒素的载体DNA
• 根据用户实际情况，建议使用空载体对照或报告基因标记对照
• 建议使用的包装细胞须经过筛选，例如Bosc23细胞使用霉酚酸筛选，建议使用 Bosc23细胞克隆选择培养基（12086）
• 孵育时建议将培养瓶密封，以防或避免转染工作液蒸发
• 更换液体时，须小心，以防细胞松动或脱落
• 如果转染孵育后，出现较多细胞松动和脱落，直接加入5毫升用户自备的完全细胞培养液，继续孵育24小时后，进行更换
• 本产品提供的成分配比优化
• 如果转染不理想，可以适当调整转染液、强化液和DNA用量
• 病毒悬液严禁冻融超过2次
• 本公司提供系列病毒试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定转染效率高