GST-resin

 

GST-resin 纯化柱系采用进口填料分装而成，性质稳定，重复性好，使用简单、方便。胶粒平均直径60微米，比表面积大，结合大肠杆菌重组GST蛋白的能力大于8 mg/ml。可以满足大多数实验室级别小量纯化GST融合蛋白的需求。

1.         离心收集250 ml表达目标蛋白的大肠杆菌，冻融或超声破菌于10-15 ml破菌缓冲液。破菌缓冲液: 20-50 mM Tris-HCl，pH 7.5-8.5，含0.25 M NaCl，其它常用缓冲液为PBS。这一步可以适当加入EDTA，PMSF等蛋白酶YZ剂。

2.         离心取上清，上样于预先平衡好的纯化柱，通常自然流速可以很好结合。少数情况下，流速过慢，可以使用硅胶管控制上样速度。

3.         样品上完以后，使用破菌缓冲液洗柱10-20个柱体积，注意将纯化柱侧壁上的残留样品洗干净。

4.         使用2-4 ml洗脱缓冲液将样品从GST-resin纯化柱上洗脱。洗脱缓冲液：破菌缓冲液中补加新配制还原型谷胱甘肽（GSH）到终浓度6 mM，10 mg GSH干粉可配制5 ml洗脱缓冲液。

5.         纯化结束以后，使用20倍柱体积1% 醋酸冲洗纯化柱，再使用PBS/TBS平衡pH，大量纯水洗柱，ZH加入5 ml 20%乙醇，保存在4 ℃，不要在-20 ℃冻结，仔细保存可以让一根柱子反复使用。

1.         在未知GST融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程在4℃完成，可以使用蛋白酶YZ剂防止降解。此外，可以使用非离子去垢剂改善结合，具体使用浓度参考以下：1% Triton X-100，1% Tween-20，1% CTAB，10 mM DTT，0.03% SDS，0.1% NP-40。

2.         不同的融合蛋白使用不同的柱子，每根1ml的GST-resin亲和柱一次可以结合大约10 mg GST融合蛋白，样品较多，可以使用多根柱子。

3.         如果GST融合蛋白是包涵体形式，那么只有做了复性以后，才可以使用GST-resin纯化，通常的复性过程耗时、耗力，并不容易成功。

4.         洗脱缓冲液中的GSH浓度不要太高，否则会改变洗脱缓冲液的pH，通常4-10 mM就足够了。

5.         可以使用在柱酶切的方法，得到去除GST的目标蛋白。经常使用的酶包括：Thrombin；Enterokinase；TEV protease；PPase等。我们推荐TEV protease和PPase，因为这两种酶的特异性较好，都是带有Tag的重组酶，方便除去。其中PPase是和PGEX-6p-1载体配套的酶，效果很不错，欢迎尝试。

6.         洗脱的缓冲液中含有高浓度的GSH，可能影响后续的实验。可以使用超滤管或者脱盐柱进行除去。

GST-resin亲和柱纯化是最简单的纯化方式之一，通常并不容易出现问题。考虑到例外，我们把一些常见的问题列在下表中，供参考。