His-Binding-resin

 

His-Binding-resin 纯化柱系采用进口填料分装而成，性质稳定、重复性好、使用简单、方便。胶粒平均直径100微米，比表面积大，结合大肠杆菌重组His-tag融合蛋白的能力大于20 mg/ml（30 kDa）。可以满足大多数实验室级别小量纯化His-tag融合蛋白的需求。

 

1.          离心收集500 ml表达目标蛋白的大肠杆菌，冻融或超声破菌于20 ml破菌缓冲液。破菌缓冲液: 20-50 mM Tris-HCl，pH 7.3-8.3，含0.25 M-0.5M NaCl，其它常用缓冲液为PBS。这一步可以适当加入PMSF作为蛋白酶YZ剂，但是不能使用EDTA。还原剂使用2 mM 2-ME，避免使用DTT，因为DTT会造成Ni/Co离子还原。

2.          离心取上清，上样于预先平衡好的纯化柱（10倍柱体积上样缓冲液平衡），通常自然流速可以很好结合。少数情况下，流速过慢，可以使用硅胶管控制上样速度。

3.          样品上完以后，使用破菌缓冲液洗柱10个柱体积，注意将纯化柱侧壁上的残留样品洗干净。

4.          使用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去，如果杂蛋白太多可以加大洗杂体积。洗杂缓冲液：破菌缓冲液中补加咪唑到终浓度20 mM。咪唑可以使用上样缓冲液配制成500 mM母液，用前加入。

5.          洗杂结束以后，使用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。通常目标蛋白会在第二个柱体积中开始流出。洗脱缓冲液：上样缓冲液中补加咪唑到终浓度200 mM。

6.          收集完成以后，使用10倍柱体积1% 醋酸冲洗纯化柱，再使用PBS/TBS平衡pH，大量蒸馏水水洗柱，ZH加入5 ml 20%乙醇，保存在4 ℃，不要在-20 ℃冻结。

 

His-Binding-resin可以多次使用，不需要再生。如果需要使用一根柱子纯化不同目标蛋白，或者长时间使用造成金属离子脱落，柱子堵塞、流速慢，可以按照下述方法进行再生。

1.          用0.1 M EDTA洗柱4倍柱体积，将金属离子洗脱下来，再用蒸馏水洗柱10倍柱体积除去EDTA残留。如果柱子堵塞严重，使用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。

2.          使用0.1 M盐酸洗柱4倍柱体积，10倍柱体积蒸馏水冲洗，再用0.1M 氢氧化钠洗柱4倍柱体积， PBS/TBS平衡pH，大量蒸馏水洗柱。这一步需要避免强酸、强碱洗柱时间过长。

3.          用4%氯化镍或者硫酸镍3倍柱体积重新螯合10分钟，也可以使用4%氯化钴或者硫酸钴螯合柱子，颜色不同，但是在使用效果上基本没有区别。

4.          柱子长时间不用，加入20% 乙醇，封口后于4摄氏度保存，避免干裂或者冻结。

 

1.          在未知His-tag融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程在4℃完成，可以使用蛋白酶YZ剂防止降解，但是EDTA应当在纯化完成以后再加入。此外，可以使用非离子去垢剂改善结合，具体使用浓度参考以下：1% Triton X-100，1% Tween-20，0.03% SDS，0.1% NP-40。

2.          不同的融合蛋白使用不同的柱子，每根1 ml的His-Binding-resin亲和柱一次可以结合大约20 mg His-tag融合蛋白，样品较多，可以使用多根柱子。

3.          上样缓冲液中可以含有1 mM咪唑减少杂蛋白的结合，部分目标蛋白会在20 mM咪唑洗杂缓冲液中流出，所以对于新样品，每一步都要留样电泳，摸索纯化条件。

4.          如果融合蛋白是包涵体形式，那么可以选择变性纯化方法，通常是在缓冲液中加入8M 尿素以及去垢剂。变性纯化时一定要做好样品处理，不然容易造成柱子堵塞。变性方法得到的蛋白一般没有活力，可以用来制备抗体，但如想测定活力，就需要做复性。

5.          除了常规的咪唑洗脱方法以外，还有EDTA洗脱和pH梯度洗脱。后两种方法缺点明显，只在特殊情况下使用。

6.          可以使用在柱酶切的方法得到去除His-tag的目标蛋白。经常使用的酶包括：Thrombin；Enterokinase；TEV protease等。我们推荐TEV protease，因为这种酶的特异性较好，是带有His-Tag的重组酶，方便除去。在柱酶切可以提高产物纯度，但是空间位阻可能造成酶切效果不好，按照惯例，多数实验不用切除His-tag。