Protein A/G-Plus

 

本产品Protein A/G-Plus Beads是将重组Protein A/G蛋白分子共价交联到4%琼脂糖胶粒上，再使用特殊试剂对琼脂糖胶粒表面进行后处理，降低了胶粒对杂蛋白的非特异性吸附。Protein A/G-Plus Beads 分散在含有0.01%叠氮化钠的PBS缓冲液中，用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究。2 ml包装内含有0.5 ml Beads，可进行100次常规的免疫沉淀试验。

1.         对于100 mm培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，使用预冷PBS洗涤一次后加入2毫升细胞裂解液裂解细胞。对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考100 mm培养皿的裂解液的用量进行裂解。裂解液ZZ蛋白浓度选择在0.5-1 μg/μl范围内，较为合适。

2.         取200微升至1毫升蛋白样品，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG（nomal IgG）和20微升充分重悬的Protein A/G-Plus Beads，4℃缓慢摇动30分钟。

3.         2500rpm(约1000 g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：现在已经知道，哺乳动物细胞内有多种成分可以和IgG发生结合，可能会在后续免疫印迹中出现非特异性条带。使用normal IgG和Protein A/G-Plus Beads对裂解液预处理，可以降低非特异性吸附。

4.         加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动1小时。

5.         再加入20微升充分重悬的Protein A/G-Plus Beads，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A/G-Plus Beads的量调整为40微升。)

6.         2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A/G-Plus Beads。

7.         用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀4次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3。

8.         完成ZH一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。

9.         100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳。