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北京百奥莱博生产销*(代"售")的北京乙型流感病毒分型荧光PCR检测试剂盒(IFVB-V1)现货供应,是高品质的病毒PCR检测试剂盒产品,欢迎的您垂询订购。
名称:北京乙型流感病毒分型荧光PCR检测试剂盒(IFVB-V1)现货供应
品Pai:百奥莱博
编号:SYA196
规格:48次/盒
产地:国产|进口
等级:科研试剂
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规格:48次/盒
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规格:192次/盒
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规格:48次/盒
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规格:48次/盒
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等级:科研实验专用
规格:48次/盒
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编号:SYA324
英文名称:Fluorescent PCR detection kit for Vibrio cholerae
等级:科研实验专用
规格:48次/盒|96次/盒
一、简介:
本试剂盒用一对禽流感病毒H5亚型特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光RT-PCR技术对禽流感病毒H5亚型RNA进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中禽流感病毒H5亚型的探针报告基团为FAM。
二、用途:
本试剂盒适用于喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各种组织样品、尿囊液及细胞培养液中的禽流感病毒H5亚型的特异性检测。适用于禽流感病毒H5亚型感染的辅助诊断、监测及流行病学调查,其检测结果仅供临床参考。
三、试剂盒组成:(48T)
组份 数量 规格
禽流感H5荧光qRT-PCR反应液(H5-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(H5-PTC) 1管 50μL/管
四、储存条件及有效期:
本试剂盒于-20℃以下保存,有效期为6个月。
五、荧光PCR仪器适用范围:
ABI系列,Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。
六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-80℃,但不能超过6个月,标本运送应采用0℃冰壶。
6.1.1 血清:用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL,注入无菌的干燥玻璃管,室温(22-25℃)放置30-60min,血标本可自发完成凝集析出血清,或直接使用水平离心机,3000rpm离心5min,吸取上层血清,转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.2 血浆:用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL,注入含EDTA2Na(乙二*(代"胺")四乙酸二*)或柠檬酸*抗凝剂的玻璃管,立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次,使抗凝剂与静脉血充分混匀,5-10min后即可分离出血浆,转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.3 拭子、分泌物等样品:在装有拭子或分泌物的离心管中加入500μL PBS或生理盐水,剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中,6000rpm离心20s,取上清备用。
6.1.4 病灶组织样品:称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(置于冰上或加入液氮),再加1mL生理盐水研磨至无块状物,然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm离心2min,取上清液于1.5mL灭菌离心管中。
6.2 RNA提取
可按常规方法提取,也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。
6.2.1 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管,做好标识。
6.2.2 加入600μL裂解液,200μL样本,200μL*仿,混匀器上振荡5 s,4℃ 12000 rpm离心15 min。
6.2.3 吸取步骤6.2.2中的上清液转移至新的无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管中(避免吸出中间层),加入400 μL 异丙醇,颠倒混匀。
6.2.4 4℃ 12000 rpm离心15 min,弃上清;加入600 μL 75%乙醇。
6.2.5 4℃ 12000 rpm离心10 min,弃上清。打开离心管管盖,室温干燥5 min-10 min。
6.2.6 加入10μL 无核酸酶水,溶解管底的RNA,5000 rpm离心5 s,-20℃保存。若长期保存需放置-80℃冰箱。
注:阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取),直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高,建议ZH在样品制备区域加入阳性对照。
七、检测步骤:
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(H5-qRT-PCRMIX)、酶混合物(EnzymesMIX),冰上融化并振荡混匀后,10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下:
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合液 1µL N×1µL
总量 15µL N×15µL
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加15μL,向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(H5-PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qRT-PCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM。
八、结果分析
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的ZG点为准。
8.2 试验成立判定
(1)阴性对照(NTC):不应产生任何的扩增曲线。
(2)阳性对照(H5-PTC):均产生扩增曲线。
(3)以上条件应同时满足,否则,此次试验视为无效。
8.3 结果判定
(1)在试验成立的条件下,Ct值≤35的样本为阳性,表明H5核酸阳性。
(2)Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明H5核酸阴性。
(3)如果35<Ct值≤40,判为可疑样品。对于可疑样品,先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线,则为可疑阳性,否则判为阴性。
(4)对于可疑阳性样品,重新抽提核酸,再次进行H5qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线,判为样本阳性,表明H5核酸阳性;否则判为样本阴性。
九、注意事项
(1)初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2)所有使用的离心管高压灭菌,而且必须不含RNA酶。
(3)PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等),防止实验室污染。
(4)样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
(5)试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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温馨提示:不可用于临床ZL。