单细胞RNA扩增试剂盒 克隆与表达

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、YL及其他非科研用途。

北京百奥莱博供应的单细胞RNA扩增试剂盒 克隆与表达用于生化研究，本产品质量好，且极具价格优势，深为用户称道，了解更多单细胞RNA扩增试剂盒等克隆与表达产品请联*(代"系")我司咨询订购。

名称：单细胞RNA扩增试剂盒 克隆与表达
规格：80次
品Pai：百奥莱博
英文名：Single Cell RNA Amplification Kit
产地：国产|进口
一个哺乳动物单细胞一般只有约10pg的总RNA，其中的mRNA 只有1-5%(约10E5-10E6个分子),因此直接用单细胞进行mRNA扩增具有极大的技术难度。本公司进过精心研究，整合ZX技术，开发出了可以直接用单个细胞进行mRNA扩增的试剂盒，其原理如下(仅以扩增mRNA 链为例)：


产品特点：
1. 双向，既可用于制备正义的mRNA，也可用于制备反义的aRNA(antisense RNA)或cRNA(complimenary RNA)。
2. 直接用单细胞裂解液进行反应，免RNA提取，整个过程只需要半天。
3.适用于多种单细胞，包括卵细胞、干细胞、FACS分离细胞等单细胞，还可用于培养细胞和胚胎等实体租组织(需要单细胞化)，也可以使用10pg-10ng 纯化的总RNA作为模板。
4. 假阴性和假阳性率均小于6%，RNA扩增成功率为90%。
5. 所得mRNA或aRNA(cRNA)可以直接用于后续的RT-PCR、芯片杂交、表达谱分析等实验。
6. 本试剂盒足够对80个单细胞进行单细胞RNA扩增。

成分	规格
P1(cDNA一链合成引物)	360μl
P2(cDNA 二链合成引物)	360μl
P3(T7-cDNA 二链合成引物)	100μl
溶液A(4×细胞裂解液)	100μl
溶液B(RI)	10μl
溶液C(逆转录酶)	40μl
溶液D	10μl
溶液E	10μl
溶液F	150μl
溶液G(TdT)	60μl
超纯水	10μl
PCR 3.0	9ml
转录预配液，2×	500μl
T7 RNA聚合酶	50μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
强烈建议首次使用本产品前，先预实验，用纯化好的任何总RNA 10倍系列稀释，直到浓度为25pg/μL，然后用0.4μL(即10pg RNA，相当于单个细胞的总RNA量)按本操作说明书进行扩增，一次需平行做4-10个重复。
下列步骤仅用于制备mRNA，如果需要制备aRNA(cRNA)，则需要把P1和P2引物对换，其他成分不需要做任何改动。

一：新鲜准备工作液
见手册左侧各表，据此配制的的各工作液足够扩增10个单细胞用。如果一次实验没有10个细胞，工作液的量仍需按10个细胞的用量新鲜配制，冰上放置时间不能超过1小时。

二：准备单细胞悬液
如何制备单个细胞取决于实验样品和所能使用的仪器设备，此处所列步骤仅供分离单个培养细胞的参考，本试剂盒不提供相关试剂。对其他材料(如干细胞克隆、2-8细胞胚胎、胚囊、胚胎组织等)用户需自行选用合适的制备单细胞的方法。对已经处于单细胞悬浮状态的细胞(如FACS分离细胞、卵细胞等)，则可以跳过此步直接进入下步操作)：
1. 按常规胰酶方法处理培养细胞或组织，将细胞重悬于培养基中并计数。
2.转移100-4000个细胞到离心管中，400g离心4分钟，弃上清。
3. 将细胞沉淀重悬于50μL自备PBS中，使其终浓度为2-80个细胞/μL，所得细胞悬液可直接用于下面的反应。本方法一个管中可以处理1-40个细胞，但这些细胞必须是先分离成独立细胞的，不能是未分离的细胞团。

三：cDNA 合成和PCR扩增
4. 标记10个0.5mL PCR管(10 号设为阴性对照)，按下表加入各成分：

成分	1-10 号样品管
RT工作液(按下表1 配)	每管加4.0μL，共10管
细胞样品(来于第3 步)或10pg-10ng/μL纯化的RNA	1-19号加0.5μL样品(1-40个细胞)，10号用0.5μL水代替
·70℃水浴90秒，转冰上放置1分，短暂离心
溶液C(试剂盒提供)	每管加0.5μL，共10管
·总反应体系为5μL，37℃水浴90m，70℃水浴10m，冰上放置1分钟，短暂离心
Tailing预处理液(按下表2 配)	每管加1μL，共10管
·短暂离心后PCR 仪上37℃ 30m，再80℃ 25m，离心后放冰上1m
Tailing工作液(按下表3配)	每管加6μL，共10管
·短暂离心后37℃15分钟，70℃10分钟，放冰上1分钟
·上步反应管中每个取3μL分别加入2个新PCR管做模板，共分得20个PCR管。每个反应管中剩约6μL，作未PCR对照放-20℃待用。
引物+水混合液(按下表4 配)	每个PCR管加12μL，共20管
PCR Mix 3.0	每管加15μL，共20管
·按(95℃3分，50℃2分，72℃3分)参数循环1次，冰上放1分
P2	每管加1.5μL，共20管
自备PCR级石蜡油	若PCR 仪无热盖，则每管加50μL
·(95℃30秒，67℃1分，72℃3分，每次循环后在72℃的时间增加6秒)循环20次，4℃放置

5. 将模板来于一个样的2 管PCR产物汇集，20 管汇集后将得10 管(对应于10个样)，每管30μL。只有循环数在24次以上时电泳才能检测到PCR产物，故此步不需要电泳检测。
6. 用自备的PCR产物纯化回收试剂盒回收PCR产物，去除残留的引物，50μl 洗脱DNA，产物放-80C 长期保存。
7. 10个样和其对应的未PCR 对照(共20个样)各取0.5μL 为模板进行PCR或定量PCR分析，判断靶基因在哪个样品中得到了扩增和扩增效率如何。没有靶基因的可以选择看家基因。客户需自备相关引物和试剂。

四：制备含T7启动子的模板(下列操作只针对10个样品中的一个)
8. 选一个靶基因得到扩增的DNA样品(第6 步回收所得)，各取1μl 加到10个PCR 管中，各加29μl 新鲜配制的PCR Mix(按下表5 配)，混匀后按以下参数扩增1次(95℃ 5m30s，64℃ 1m，72℃ 5m18s)，再按以下参数扩增8次(95℃ 30秒，67℃ 1m，72℃ 5m18s，每次循环后将72℃延伸时间增加6秒)，PCR结束后在72℃保温10m。
9. 汇集10 管PCR反应液(共300μl)，用自备的PCR产物纯化回收试剂盒回收PCR产物，30μl 洗脱。
10. 将30μL洗脱DNA全部上样到琼脂糖胶上进行电泳(只要电泳10分钟即可，否则胶体积太大，回收效率低)，360nm紫外灯下切胶(250bp以上区域)，ZH用30-50μL 洗脱。此步所得PCR片段无250bp以下的非特异扩增产物，可直接用于后续体外转录。

五：T7 体外转录：请按该试剂盒的使用说明书操作(本产品含体外转录试剂)。

表1:RT工作液

成分	用量
超纯水	30.8μl
溶液A	11μl
溶液B	1.1μl
P1稀	1.1μl
合计	44μl

注：P1 稀是将1μl P1加入到100μL超纯水新鲜配制后得到，需新鲜配制。用户可在此步加入自备的内参，但超纯水的用量要相应减少。如加入2μL内参，则少加2μL 水。

表2:Tailing预处理液

成分	用量
超纯水	8.8μl
溶液D	1.1μl
溶液E	1.1μl
合计	11μl

表3:Tailing工作液

成分	用量
超纯水	42.9μl
溶液F	16.5μl
溶液G	6.6μl
合计	66μl

表4:引物+水混合液

成分	用量
超纯水	231μl
P1	33μl
合计	254μl

表5:PCR Mix

成分	用量
超纯水	132μl
P1	11μl
P3	11μl
PCR 3	165μl
合计	319μl

更多有关单细胞RNA扩增试剂盒 克隆与表达的价格及使用说明等，请联*(代"系")我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：

·磷酸化蛋白纯化试剂盒
编号：BTN130883
英文名称：Phosphorylated proteins purification kit
规格：50次

·HRP标记亲和素
编号：BTN131086
英文名称：HRP-Avidin
规格：2mg
本产品为辣根过氧化物酶标记的亲和素干粉，每摩尔亲和素含有1-2mol辣根过氧化物酶，结合能力为5-10μg生物素/mg蛋白≥80过氧化物酶单位/mg蛋白。本品常用在内源磷酸酶会对实验造成影响的免疫组化中使用以及免疫印记。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

·3mL亲和层析柱
编号：BTN140650
英文名称：Affinity Chromatography Colum(3mL)
规格：3mL
本产品适用范围广泛，可用于纯化分离重组蛋白、抗体和抗原、多肽、糖蛋白、磷酸化蛋白、DNA及DNA结合蛋白等生物大分子；还可以用于去除生物样品中的内毒素等污染。

亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而发明的纯化技术。它是利用生物分子间存在的特异性相互作用(如抗原－抗体、酶－底物或YZ剂、激素－受体等)，通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。

亲和层析柱常见的使用方法有重力法、手动加压法、蠕动泵法，其示意图如下：


储存条件：常温运输及保存，有效期一年。

常用亲和标签及纯化方案：



单细胞RNA扩增试剂盒 克隆与表达关键词：单细胞RNA扩增试剂盒,Single Cell RNA Amplification Kit,BTN130551

天狼星红染色液-A液   100ml
ARB10847 人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体ELISA代测服务 Human Histone h2a-h2b-dna autoantibody ELISA KIT
4618-18-2 Lactulose 乳果糖
ARB13377 牛流行性出血热(EHF)免费代测 
ARB10930 人吡*(代"啶")交联物(PY)检测服务 Human pyridinium crosslink/pyrilinks,py ELISA KIT
ARB10632 人血清淀粉样蛋白A(SAA)ELISA检测服务 Human serum amyloid a,saa ELISA KIT
144-48-9 Iodoacetamide  碘代乙酰胺
5-硝基尿嘧啶 L-Methionine 611-08-5
ARB13788 豚鼠白介素4(IL-4)elisa测定使用说明书 Guinea pig interleukin 4,IL-4 ELISA KIT
PY02-135  菌种保存培养基  250克  
Ficoll 400裂解液(20%)  20%|30%|40%|50% 100ml
ARB10769 人抗SA抗体(Anti-SA-Ab)酶标法分析 Human anti-sa-antibody ELISA KIT
E0301 抗凝绵羊血(无菌 pet瓶装) 100ml/200ml/500ml
F010203 小鼠抗人IgG Fab抗体 Monoclonal Mouse Anti-Human IgG(Fab)
蔗糖溶血检测试剂盒(比色法)   50T
NF-216 羊抗人FN血清
糖原 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate 9005-79-2
L-邻**甘*酸 Baicalin 141315-50-6
单细胞RNA扩增试剂盒 克隆与表达关键词：单细胞RNA扩增试剂盒,Single Cell RNA Amplification Kit,BTN130551


·β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒
编号：BTN130599
英文名称：β-galactosidase Assay Kit
规格：24样
本产品是分光光度法测定β-GAL活力的，测定原理为β-GAL分解对-硝基*(代"*")-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基*(代"*")酚，后者在400nm有ZD吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。

β-半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中的β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。

试剂盒组成：

成分	规格
酶提取液	50ml
溶液A	粉剂1瓶
溶液B	15ml
溶液C	50ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，4℃保存，其中试剂A需-20℃保存，有效期半年。

使用方法：
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

一、酶液提取
1．细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104个)：酶提取液体积(mL)为500～1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酶提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20％或200 W，超声3秒，间隔10秒，重复30次)；15000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2．组织：按照组织质量(g)：酶提取液体积(mL)为1：5～10的比例(建议称取约0.1 g组织，加入1mL酶提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

二、 测定操作步骤
1．分光光度计预热30分钟以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2．取出试剂A，临用前向试剂瓶中加入5mL蒸馏水，充分溶解备用，制备成溶液A工作液(用不完的溶液A仍需-20℃保存)。
3．样本测定(在EP管中依次加入下列试剂)：

试剂名称	对照管(μl)	测定管(μl)
样本	50	50
蒸馏水	200	0
溶液A工作液	0	200
溶液B	250	250
迅速混匀，放入37℃准确水浴30分钟
溶液C	1000	1000
充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

三、酶活性计算公式
标准条件下测定的回归方程为y=0.00543x -0.0027；x为标准品浓度(nmol/mL)，y为吸光值。
注：V反总：反应总体积，0.5mL；V样：反应中样本体积，0.05mL；V样总：加入酶提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，30分钟。
1．按照样本蛋白浓度计算：
 酶活性定义：每mg 组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基*(代"*")酚定义为一个酶活力单位。
 β-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=61.39×(ΔA+0.0027)÷Cpr
 如果需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
2．按照样本鲜重计算：
 酶活性定义：每g组织每分钟产生1nmol对-硝基*(代"*")酚定义为一个酶活力单位。
 β-GAL活力(nmol/min/g鲜重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=61.39×(ΔA+0.0027)÷W
3．按细菌或细胞密度计算：
 酶活性定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol 对-硝基*(代"*")酚定义为一个酶活力单位。
 β-GAL活力(nmol/min/104cell)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.123×(ΔA +0.0027)

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