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北京百奥莱博专业生产销*(代"售")北京现货一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(高含量ROX校正染料)打折促销,我公司供应的分子生物学试剂品类齐全,且具有优势价格,欢迎新老客户垂询订购。
名称:北京现货一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(高含量ROX校正染料)打折促销
规格:100次
编号:WE0139
产地:国产|进口
本试剂盒是一步法Real-Time RT-qPCR专用试剂盒。所含的SYBR Green I荧光染料可以与所有的双链DNA相结合,使该产品可以用于多种不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应,逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行,反应过程中无需添加试剂,无需打开管盖,避免了污染的同时提高了实验效率。全新GX逆转录酶RNase H活性缺失,减少了逆转录反应中RNA的降解。该酶逆转录效率高,可对少量 RNA模板进行良好的逆转录反应。与RNA亲合性高,能通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板。全新GX热启动酶,在常温下酶的活性被封闭,从而有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增,极大提高了荧光定量PCR反应的精确性。所包含的缓冲系统使以上两种酶同时发挥ZD功效,提GX率。本产品灵敏度高,特异性高,线性范围广,对目的基因定量更准确。
ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差,一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同,因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器:(WE0137)
Roche LightCycler 480,Roche LightCyler 96,Bio-rad iCyler iQ,iQ5,CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器:(WE0138)
ABI Prism7500/7500 Fast,QuantStudio® 3 System,QuantStudio® 5 System,QuantStudio® 6 Flex System,QuantStudio® 7 Flex System,ViiA 7 system,Stratagene Mx3000/Mx3005P,Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器:(WE0139)
ABI Prism7000/7300/7700/7900,Eppendorf,ABI Step One/Step One Plus等。
试剂盒组成:
组份 | WE0137-100次 | WE0138-100次 | WE0139-100次 |
2×SuperSYBR One Step Buffer | 1.4ml | 1.4ml | 1.4ml |
SuperSYBR One Step EnzymeMix | 50μl | 50μl | 50μl |
50×Low ROX | - | 50μl | - |
50×High ROX | - | - | 50μl |
RNase-Free Water | 1.5ml | 1.5ml | 1.5ml |
注意事项:
1、本试剂盒中的各试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验,在操作过程中应避免RNase污染,建议在专门的区域进行RNA操作,使用专门的仪器和耗材,操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套,实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、SuperSYBR One Step RT-qPCR Buffer中含有SYBR Green I 荧光染料,保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
4、本试剂盒中的各试剂应避免反复冻融,反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃,避光。如果在短期内需要频繁使用,可在2~8℃保存。
5、本试剂盒必须使用特异性引物,引物的选择可根据具体实验来选择,引物设计的好坏直接影响到RT-PCR反应的结果,设计引物时需考虑GC含量,引物长度,引物位置,PCR产物的二级结构等因素,建议采用专业的引物设计软件进行设计。
6、本品不能用于探针法荧光定量PCR。
操作步骤:
1、将RNA模板、引物、2×SuperSYBR One Step Buffer、SuperSYBR One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系
试剂 | 25μl反应体系 | 终浓度 |
2×SuperSYBR One Step Buffer | 12.5μl | 1× |
Forward Primer,10μM | 0.5μl | 0.2μM |
Reverse Primer,10μM | 0.5μl | 0.2μM |
SuperSYBR One Step EnzymeMix | 0.5μl | |
RNA Template | Xμl | 10 pg~100ng |
50×Low ROX or High ROX(optional) | 0.5μl | 1× |
RNase-Free Water | up to 25μl | |
注意:
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果,可以终浓度0.1-0.5μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。
2)不同仪器的激发光学系统有所不同,根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。
3、涡旋震荡混匀,短暂离心,将溶液收集到管底。
4、RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为两步法),本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为例。
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
反转录 | 45℃ | 10 min | |
PCR预变性 | 95℃ | 5 min | |
变性 | 95℃ | 10 s | 30-40个循环 |
退火/延伸 | 60℃ | 45 s |
融解曲线分析 | 95℃ | 15 s | |
60℃ | 1 min | |
95℃ | 15 s | |
60℃ | 15 s | |
注意:
1)建议采用两步法PCR反应程序,若提高反应特异性,可提高退火温度,以60-64℃作为设定范围的参考;若因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试进行三步法PCR扩增。
2)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定,本程序是以ABI7500荧光定量PCR仪为参照设定。
RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为三步法):
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
反转录 | 45℃ | 10min | |
PCR预变性 | 95℃ | 5min | |
变性 | 95℃ | 15s | 30-40 个循环 |
退火 | 56℃-64℃ | 30s |
延伸 | 72℃ | 30s |
融解曲线分析 | 95℃ | 15s | |
60℃ | 1min | |
95℃ | 15s | |
60℃ | 15s | |
注意:
1)三步法PCR扩增时,退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。
2)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定,本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定。
储存条件:-20℃,避免反复冻融
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·显影粉
编号:WE0303
英文名称:Developing Powder
规格:20套
·Taq酶抗体
编号:WE0121
英文名称:Taq Antibody
规格:500U|2500U
本品是抗Taq酶鼠单克隆抗体,适用于Hot Start PCR。Taq Antibody与Taq酶结合后能YZDNA聚合酶活性,进而能够在低温条件下有效YZ引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。Taq Antibody在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性,DNA聚合酶活性恢复,达到热启动效果。因此无需对Taq酶抗体进行特殊失活处理。
产品特点;
1、在37℃,可YZ>95%的聚合酶活性。
2、可提高PCR反应的特异性和灵敏性,包括复杂的人基因组DNA或cDNA模板,低拷贝的模板,多重PCR等。
3、PCR反应速度快于普通化学修饰的聚合酶。
活性定义:Taq Antibody与Taq DNA Polymerase混合,25℃孵育15 min后,将在37℃,30 min条件下YZ97%以上的1 U的Taq DNA Polymerase活性的Taq Antibody量定义为1U。
使用方法:
将Taq DNA Polymerase和Taq Antibody等体积混合,20-25℃下放置15 min冰上待用。
注意:通过实验,我们建议Taq Antibody和 Taq DNA Polymerase混合的分子数之比为13:1较为合适,实际操作中由于引物、目的产物或Taq DNA Polymerase不同,可以摸索一系列的比例以得到最合适的结果。
以下举例为以人基因组DNA为模板,扩增300 bp的片段的PCR反应体系和反应条件,实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。
1、PCR反应体系
试剂 | 50μl反应体系 |
10×PCR Buffer | 5μl |
dNTP Mix,10μM each | 1μl |
Forward Primer,10μM | 1μl |
Reverse Primer,10μM | 1μl |
Template DNA | 4μl |
Taq酶和抗体的混合液 | 0.36μl |
ddH2O | up to 50μl |
2、PCR反应条件,可以按照各种PCR用DNA Polymerase的常规PCR反应条件进行PCR反应。
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 2 min | |
变性 | 94℃ | 30 s | 25-35 个循环 |
退火 | 55-65℃ | 30 s |
延伸 | 72℃ | 30 s |
终延伸 | 72℃ | 2 min | |
储存条件:-20℃,避免反复冻融。
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温馨提示:不可用于临床ZL。