GST琼脂糖凝胶 蛋白质研究

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、YL及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括GST琼脂糖凝胶 蛋白质研究在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：GST琼脂糖凝胶 蛋白质研究
品Pai：百奥莱博
英文名：Glutathione-Sepharose Resin
规格：10ml
产地：国产|进口
编号：WE0269
  本产品为基于三甘醇(16原子间隔臂)的谷胱甘肽琼脂糖，可快速、温和、特异性地纯化包含谷胱甘肽结合序列的非变性蛋白质，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶等，尤其适用于在大肠杆菌、昆虫细胞和哺育动物细胞中表达的GST融合表达蛋白。该填料具有很好的物理和化学稳定性，使用寿命长，使用方便，批次重复性好，可一步分离得到纯度较高的目标蛋白，纯化条件温和，可保证蛋白的活性。

支持物：CL-6B琼脂糖凝胶
载量：5-10 mg GST标签蛋白/ml 填料
粒径：50-160μM

注意事项：
1、请勿将 GST琼脂糖凝胶冷冻、干燥和离心，整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
2、蛋白层析应使用高纯度的试剂和水，层析前缓冲液应用0.45μM滤膜过滤后使用。另外为防止柱子阻塞，上柱前建议将裂解液进行离心，或者使用0.45μM滤膜过滤。
3、GST 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得ZD结合量，上样流速建议为：0.2-1ml/min(6ml层析柱)，0.5-2ml/min(12ml层析柱)。对于吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇 2-4小时，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作，另外在细菌抽提试剂中添加5 mM DTT，可以显著提高GST标签结合能力。
4、不同的 GST 融合蛋白取得ZJ纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行 SDS-PAGE 以及 Western 杂交分析，以确定ZJ纯化条件。
5、GST 融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。建议优化蛋白表达条件尽量使蛋白可溶性表达。
6、如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。

使用方法：

I 缓冲液的准备
1、结合缓冲液(PBS)：10 mMNa2HPO4，1.8 mMKH2PO4，140 mMNaCl，2.7 mMKCl，pH7.4
2、洗脱缓冲液：10 mMNa2HPO4，1.8 mMKH2PO4，140 mMNaCl，2.7 mMKCl，10 mM还原型谷胱甘肽(GSH)，pH7.4。将0.1 g还原型谷胱甘肽(GSH)溶于30ml 结合缓冲液，或将0.25 g溶于75ml结合缓冲液中。
3、再生缓冲液1：0.1 MTris-HCl，0.5 MNaCl，0.1% SDS，pH8.5
4、再生缓冲液2：0.1 M Sodiumacetate，0.5 MNaCl，0.1% SDS，pH4.5

II 样本制备
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加1-5ml细菌蛋白抽提试剂(每1ml细菌蛋白抽提试剂中加入10μl蛋白酶YZ剂混合物)，如有需要可以超声裂解菌体。
注意：
1)当提取物粘度高时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1ml 细菌抽提试剂中加入1μlDNase I(1000U/ml)，2μl Lysozyme(50 mg/ml)，DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买，货号：Lysozyme(WE0214)、 DNase I(WE0213A)，或直接从我公司购买WE0261细菌蛋白抽提试剂盒，包含细菌蛋白抽提试剂、DNase I、Lysozyme和蛋白酶YZ剂混合物。
2)超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致溶液过热，可分成短时间，多次超声，ZZ以菌液变清即可。
2、10000rpm，4℃离心15分钟，将上清转移至新的已预冷的离心管中，然后用预冷的PBS Buffer重悬沉淀(每50ml裂解液的沉淀加入3ml PBS)。
3、分别取10μl上清和沉淀悬液进行SDS-PAGE电泳检测，以确定蛋白存在于上清或沉淀中。若目的GST融合蛋白形成包涵体(不可溶蛋白)，应在纯化以前以适当的方式进行溶解和重折叠。

III 组装层析柱
1、将Glutathione-Sepharose Resin混合均匀直至重悬，用吸管移取适量的填料至层析柱中。室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：
1)填料的上层是乙醇保护液，将填料与乙醇一起混匀，以每ml填料纯化5-10 mg GST标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇混合液加入层析柱中。
2)如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2、加入5倍柱体积的去离子水洗涤，再用10倍柱体积的结合缓冲液平衡，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。

Ⅳ GST融合蛋白的纯化
1、将层析柱的出口连接上紫外蛋白监测仪，根据紫外蛋白监测仪观察280 nm处的吸收值来监控层析柱流出蛋白情况。
2、上样：将制备的蛋白样品用结合缓冲液等体积稀释后，加入到已平衡好的层析柱中，建议上样流速为： 0.5-1ml/min(6ml层析柱)，1-2ml/min(12ml层析柱)。观察280 nm吸收情况并收集流穿蛋白。
注意：
1)样品在上柱前可以离心或0.45μM微孔滤膜过滤。或者使用本试剂盒中附带的一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
2)通过控制加入的菌体裂解液的速度或流出速度来控制柱流速，流速过快会影响柱效。
3、洗涤：使用10倍柱体积的结合缓冲液过柱，洗涤杂蛋白，观察280 nm吸收情况并收集杂蛋白。建议洗涤流速为0.5-1ml/min(6ml层析柱)，1-2ml/min(12ml层析柱)。
注意：建议洗涤液中加入蛋白酶YZ剂终浓度为1mM，如蛋白酶YZ剂混合物，以YZ蛋白酶活性。
4、洗脱：使用10-15倍柱体积的新鲜配制的洗脱缓冲液过柱，洗脱目的蛋白，观察280 nm吸收情况并收集目的蛋白。建议洗涤流速为0.5-1ml/min(6ml层析柱)，1-2ml/min(12ml层析柱)。
5、蛋白检测：分别取等量的流穿液，洗涤液和目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE以分析蛋白的层析情况。
6、洗脱后，依次用3-5倍柱体积的结合缓冲液和3-5倍柱体积的去离子水洗涤填料，再用2-3倍柱体积的20%乙醇洗涤(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。

Ⅴ 柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有下降，可用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1、使用5倍柱体积的再生缓冲液1洗涤填料，而后用5-10倍柱体积超纯水洗涤。
2、使用5倍柱体积的再生缓冲液2洗涤填料，而后用5-10倍柱体积超纯水洗涤。
3、保存：使用2-3倍柱体积的20%乙醇洗涤，将层析柱的头尾密封后(乙醇要将填料浸没)2～8℃保存。
4、再次使用时加入5倍柱体积的去离子水将乙醇洗涤后，使用10倍柱体积的结合缓冲液平衡填料，平衡结束后即可上样。

储存条件：2～8℃，避免冷冻

更多有关GST琼脂糖凝胶 蛋白质研究的价格及使用说明等，请联系我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：
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·Bes Taq DNA Polymerase
编号：WE0103
英文名称：Bes Taq DNA Polymerase
规格：500U|2500U
  Bes Taq DNA Polymerase具有5"→3"DNA聚合酶活性和5"→3"外切核酸酶活性。在普通的PCR条件下，与Taq DNA Polymerase相比，具有扩增效率高、错配率低的优良性能，兼具有Taq DNA Polymerase的高扩增效率和Pfu DNA Polymerase的高保真性。使用本品扩增得到的PCR产物3"端附有一个“A”碱基，因此可直接用于T/A克隆。本产品适用于常规的PCR反应和对保真性有要求的基因克隆等反应。

产品组成：

 

组份	500 U	2500U
Bes Taq DNA Polymerase, 5 U/μl	100μl	5×100μl
10×PCR Buffer	1.8ml	5×1.8ml

活性定义：
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；
5、室温存放一个月，无明显活性改变。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
10×PCR Buffer	5μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
Bes Taq DNA Polymerase，5 U/μl	0.25-0.5μl	1.25-2.5U/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2min
变性	94℃	30s	25-35个循环
退火	55-65℃	30s
延伸	72℃	30s
终延伸	72℃	2min

注意：
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2)延伸时间应根据所扩增片段大小设定，本产品Bes Taq DNA Polymerase的扩增效率为2 kb/min。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。


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