特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、YL及其他非科研用途。
北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域,致力于为客户提供包括SABC(兔IgG)-POD免疫组化试剂盒 细胞及免疫学在内的一系列分子生物学试剂产品,并提供一系列相关的技术服务。
名称:SABC(兔IgG)-POD免疫组化试剂盒 细胞及免疫学
品Pai:百奥莱博
编号:XH110
规格:100T
试剂盒组成:
1, 封闭液(5%BSA):10ml。
2, 3% H2O2:10ml。
3, Bio-羊抗兔IgG:浓缩液100ul。
4, SABC-POD:浓缩液100ul。
5, 稀释液:30ml。
6, 显色液(1ml+1ml):20×DAB显色液A,20×DAB显色液B。
试剂盒保存:如果一段时间不使用,请将所有试剂存放于-20℃,如经常使用,可将封闭液,封闭液和20×DAB显色液B存放于2-8℃以方便使用
试剂盒简介:
本试剂盒适合于一抗为兔IgG的免疫组化实验. DAB显色。
SABC是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的,用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素(StreptAvidin)是一种从链霉菌中提取的蛋白质,同亲和素一样,对生物素有极高的亲和力,亲和素是一个碱性蛋白质(IP=10),经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性,对组织和细胞的非特异吸附很低,基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。大量的酶将保证SABC具有很高的敏感性。
自备试剂:
1.粘片剂多聚赖氨酸
2. 0.01 M PBS(pH7.2-7.4)
3. 0.01M柠檬酸钠缓冲液
4、苏木素
实验步骤: 微量试剂请离心后使用
以石蜡切片为例
1. 切片常规脱蜡至水(三次二甲苯,三次乙醇)。
2. 3%H2O2室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
3.可选步聚:a、热修复抗原,将切片浸入0.01M 柠檬酸钠缓冲液(PH6.0),电炉或微波炉加热至沸腾后断电,间隔5-10分钟后,反复1-2次。冷却后PBS(pH7.2-7.4)洗涤1-2次。b、酶消化,滴加消化液,37℃10分钟, PBS(pH7.2-7.6)洗涤2-3次。c、跳过此步,直接进入下一步。
4. 滴加5%BSA封闭液,室温20分钟。甩去多余液体, 不洗。
5.用稀释液将一抗(如兔抗IL-10)按一定比例稀释(稀释后的一抗4℃可保存一周),也可另行购买抗体稀释液。滴加稀释的一抗,37 ℃ 1小时左右或20℃时2小时左右。也可4℃过夜。PBS(pH7.2-7.4)洗2分钟×3次。(一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说,阳性染色强度不够时,可提高一抗浓度和延长孵育时间;背景过高时,可降低一抗浓度和缩短孵育时间。)
6.根据使用量,用稀释液将Bio-羊抗兔IgG浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10ul Bio-羊抗兔IgG浓缩液,混匀即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加Bio-羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分钟。PBS(pH7.2-7.4)洗2分钟×3次。
7.根据使用量,用稀释液将SABC-POD浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10ul SABC-POD浓缩液,混匀即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃,30分钟。PBS(pH7.2-7.4)洗5分钟×4次。
8.DAB显色:根据用量,用PBS(pH7.2-7.4)配制,按1mlPBS加入50ul 20×DAB显色液A,加入50ul 20×DAB显色液B 。混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间,一般在5-30分钟之间。蒸馏水洗涤终止反应。
9.苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。
对于细胞片,常规固定后,PBS漂洗两次,再用0.5%Txiton X-100室温20分钟,PBS漂洗两次,3%H2O2处理15分钟;PBS漂洗两次,下接上面第4步。
对于冰冻切片,固定后,可用PBS漂洗两次,再接上面第二步。
注意事项:如果染色背景过高,在SABC反应之后,DAB显色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST(pH7.2-7.4)洗涤切片4次,PBS洗2次,然后DAB显色。
因为免疫组化指标众多,标本不一,此步骤仅作参考。
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·50×Denhardt溶液
编号:XH041
规格:100ml
试剂组成:聚蔗糖(Ficoll,400型),聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40) 和BSA(组分V)
配制方法(1L): 聚蔗糖(Ficoll,400型) 10g
聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40) 10g
BSA(组分V) 10g
加水至总体积为800ml,溶于水中定容(1L)。过滤除杂,分装-20℃贮存。
此产品只适合于DNA方面的实验,并不适合于RNA实验。
·TOP10受体菌
编号:XH045
规格:1ml
基因型:F-,supE44,hsdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1
细胞种类
GX常用宿主菌E.coli HB101
E.coli HB101在基因重组实验起始时便十分常用。遗传性能稳定,使用十分方便,适合于各种基因重组实验。
保存:所有受体菌均为甘油保存,-70℃可长期保存,-20℃可保存一年。
·鲑鱼精DNA(10mg/ml)
编号:XH017
规格:1ml
此溶液已经经过处理,可以直接用于DNA杂交。原料来自于SIGMA。
处理配制方法如下:
1. 称取鲑鱼精DNA 2 g置于500 ml烧杯中,加入约200 ml的TE Buffer。
2. 用磁力搅拌器室温搅拌2~4小时,溶解后加入4 ml的5 M NaCl,使其终浓度为0.1 M。
3. 使用氯*(代"仿")抽提两次。加大约2倍体积,取上面冻状物。
4. 回收水相溶液后,使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次,以切断DNA。
5. 加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。
6. 离心回收DNA后,溶解于100 ml的去离子水中,测定溶液的OD260值。
7. 计算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10 mg/ml。
8. 煮沸10分钟后,分装成小份(1 ml/份)。-20℃保存。
9. 使用前在沸水浴中加热5分钟后,迅速冰浴冷却。
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·5×蛋白上样缓冲液(配有β-巯基乙醇)
编号:XH056
规格:10ml
产品简介:
本产品适用于SDS-PAGE(SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)时作蛋白质上样用。其主要成份为SDS,β-巯基乙醇,溴酚蓝,缓冲盐溶液等。
SDS可与蛋白质结合使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷,这时蛋白质本身的电荷完全被SDS掩盖,消除了各种蛋白质本身电荷的差异,SDS还可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构,β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,消除了蛋白结构之间的差异。ZZ无电荷及结构上差异的蛋白(亚单位),电泳速度只是与其分子量大小有关。溴酚蓝用作电泳时的指示剂,可大概指示电泳结束的时间。
保存时间:
未混合前2-8℃可保存一年,混合后保存三个月。
使用说明:
1. 根据用量,以每1ml的5×蛋白上样缓冲液加入50ulβ-巯基乙醇,混匀。此即为配好的蛋白上样缓冲液。此配好的蛋白上样缓冲液在2-8℃保存三个月。
2. 请按每40微升蛋白样品加入10ul配好的上样缓冲液的比例来使用。如果蛋白浓度过高,可用双蒸水稀释。
3. 混匀后,100℃水浴加热3-5分钟,使蛋白变性。
4. 冷却到室温后,离心数秒后,混均再离心30秒取上清直接上样即可。
注意事项:
β-巯基乙醇味道特别难受,所有操作是在通风柜中操作。如果没有通风柜,也尽量找一通风处操作,或者使用5×蛋白上样缓冲液(含DTT)。
8%胶时溴酚蓝大概在30kd左右, 12%胶时,约在20kd左右,15%胶时,大概在10kd。请根据自己目标条带来判断结果电泳时间。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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·Western blotting检测试剂盒(DAB)
编号:XH079
规格:10T
试剂盒组成
1. 封闭试剂:30g(可配制400ml)脱脂奶粉及其他蛋白,缓冲盐等混合物。
2. 10倍浓缩抗体稀释液,50ml。
3. HRP标记二抗,0.5ml,效价1:400。
4. DAB显色液(20×),5ml A+5ml B。
原理:
SDS-PAGE电泳后,蛋白质按照分子量大小分离,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)后,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶标记的第二抗体起反应,经过底物显色以检测电泳分离的特异性的蛋白。
操作步骤:
常规电泳转膜后,
1) 清洗转印膜:将膜剥离下后,作好标记,一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T漂洗3次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS,防止影响后面的抗体结合。
2) 按5g封闭试剂加100ml双蒸水计,配制膜封闭液,配好的膜封闭液为乳白色悬液,将漂洗过的转印膜,封闭液内,摇床震动,室温封闭30min。 A@ 3) 用TBS-T ,PH7.6洗液,室温漂洗3次每次5min。
3)将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×(10ml 10×抗体稀释液加入90ml双蒸水,混匀,可4℃保存三个月)。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。
4)用1×的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中,加入一抗工作液,封口,4℃孵育过夜或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注:如果所加一抗不同,可在此步将膜沿电泳方向剪成条,分别作好标记,分开孵育。
5)用TBS-T ,PH7.6洗液,室温漂洗3次每次5min。
6)用稀释好的抗体稀释液稀释抗体。根据用量,按10ml抗体稀释液加入10ulHRP标记二抗的比例,配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中,加入加入二抗工作液,封口,4℃孵育过夜或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。
7)用TBS-T ,PH7.6洗液,室温漂洗3次每次10min。
8)配制DAB显色:根据用量,取TBS-T 4ml,加入DAB显色液A、DAB显色液B各200ul,混匀,加在膜正面,室温下显色。在目标条带显出后,而且背景未出时,放入水中终止显色。
注意事项:
1, 请根据一抗来源选择试剂盒。括号里面代标一抗的来源而不是标本的来源。
2, western blotting DAB显色法操作简单,但其敏感性与ECL发光发有一定的差距,一般只适用于丰度较高的蛋白。
3, 可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深,可延长膜封闭时间,加长ZZ漂洗次数与时间。如果条带过弱,可延长抗体孵育时间。
4, 如果完全没有条带,请检查前期蛋白处理及实验过程, 如果确认无误,反复两次依旧无结果,请换用ECL发光法显色。
5, TBS-T(0.01M)配制方法:称取NaCl 8.5g ,Tris 1.21g ,用800ml的双蒸水溶解,用盐酸调PH到7.6,再加入0.5ml Tween-20,用双蒸水 加至1000ml,混匀即可。(也可按照自己的配制习惯来配制)
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温馨提示:不可用于临床ZL。