》》细胞实验相关问题解答《《21、细胞转染后上清收集的时间问题：问：我准备做瞬时转染，现有一问题很困惑：我是用磷酸钙法瞬时转染293T细胞，准备分12、24、36、48小时收集细胞上清然后ELISA检测细胞因子，可问题是转染试剂说明书上要求加入转染试剂4－16小时后吸去含磷酸钙沉淀的培基，加入2毫升(6孔板的用量)新鲜培基继续培养。请问我这不同时间段收集上清应该从何时算才对呢？是加入转染试剂后计时？还是换了培基后开始算？若是前者那后面三个时间段的细胞上清较12小时收集的还是有所不同呢？
答：应该从质粒转入细胞开始计算，后面只是个换液的过程。
22、caspase-3的检测方法问题：问：在本版里有看到过有关caspase-3的检测方法：
(1)免疫细胞化学检测caspase-3蛋白的表达，用悬浮的细胞；
(2)western blot 理想结果：caspase-3有32ＫＤ的条带外，还出现了20ＫＤ和10ＫＤ大小的条带，表明caspase- 3被活化；
(3)RT-PCR检测mRNA的表达，用凝胶成像分析系统处理，可以半定量。
请问是否有更详细一些的实验步骤？这3种方法之间有没有什么优缺点，那种比较容易出结果？
答：各种方法都有自己的优缺点，关键是根据实验目的选择适合的方法。
检测mRNA水平的表达，RT－PCR是广泛应用的比较好的方法；
检测蛋白水平的表达，可以选择免疫细胞化学，Westen－Blot等，前者可以在细胞内定位但定量效果不佳，后者操作比较复杂，如想在较高水平杂志发表论文选择此方法。检测Caspase－3活性还可以选用流式细胞仪来做，且可同时测定Caspase－8等的活性(多通路)。
23、HEPES(20mM)-Hank's(pH7.4)的配制方法问题：问：请问低血清培养基的制备方法，是小牛血清。
答：hank's液就是hbss缓冲液，HEPES(20mM)-Hank's(pH7.4)应该就是指1L的hbss缓冲液里面含有20mM的HEPES。
你查一下HEPES的分子量，就知道怎么配了。低血清培养基，就是培养基里面加入的血清比较少，eg：我要配0.1%血清的培养基，就是100ml的培养基加入0.1ml的血清。
24、流式细胞的问题：问：细胞用一抗包被后，然后再和二抗结合，不知道这样能否用流式细胞检测？由于我要检测的蛋白在国内外没有可用于流式细胞检测的现货，有个公司虽然可制备，但需要6个月，并且价格一个蛋白要5万元以上，时间和经费均不足，只好想想其它办法，不知道这样可否？
答：当然可以先用自己的一抗，再用荧光标记的二抗，不过非特异性会要高一点。
解决方法：摸索一下一抗和二抗的浓度，二抗千万不能加太多。洗涤步骤要严格，加完一抗和二抗后都要洗三遍，在EP管中进行，在96孔板里虽快，但非特异性会比较高；一抗冰浴30分，二抗冰浴20分钟染色。
25、JC-1测淋巴细胞线粒体膜电位问题：问：我想用JC-1测外周血淋巴细胞线粒体膜电位，国内有文章说：
(1)用5ml注射器抽取适量肝素，再抽取患者静脉血2.5ml，PBS溶液稀释一倍，沿装有等量淋巴细胞分离液的试管管壁缓慢加至液面上层，保持两液面清晰，2000转/分离心20分钟，吸取单个核细胞层(中间白色层，含单核细胞和淋巴细胞)，加5倍PBS溶液，1000转/分离心5分钟，弃上清，得到淋巴细胞。再悬于含有10％热灭活的胎牛血清、1％青－链霉素、10mmol/L HEPES和1mmol/L谷胺酰胺的RPMI1640培养基中，37℃和5％CO2环境中培养24小时。
(2)检测线粒体膜电位(按JC-1说明书)：
a.取10-60万细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中；
b.加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育90分钟；
c.在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴；
d.37℃孵育结束后，600g 4℃离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞；
e.用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次：加入1ml JC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g 4℃离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1ml JC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g 4℃离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清；
f.再用适量JC-1染色缓冲液(1X)重悬后，用流式细胞仪上机检测。流式细胞仪激发光波长用490nm，用一波长为527nm的通带滤器FL1-H检测绿色荧光，另一波长为590nm的滤器FL2-H检测橙色荧光，每样本至少计数105个细胞；
g.数据采集前以对照为基准调节光电倍增器电压使信号达一峰值，以平均橙色荧光强度对数值大于10部分百分比作为整体细胞线粒体膜电位的变化。数据采集后传送至电脑，ZZ由CellQuest 软件(Becton Dickinson公司产品)处理；
请问分离淋巴细胞后不培养行不行？能不能直接加荧光染色剂染色？另外，国内哪个厂家生产的JC-1比较好用呢？
答：jc-1当然是MP公司(分子探针)啦，染色20-30min，再稳定10-20min(虽然我基本不稳定，不过染flu-3还是需要的，看细胞种类)，离心时间和转速要根据细胞类型来调整，做流式对细胞状态要求高，需要摸索。配染料，可加DMDO配初浓度，分装冷冻，再取一支用PBS稀释成使用浓度的100-200倍，再分装，冷冻，用时按需所取。
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