SYA417 猪西尼罗河热病毒

特别提示：包括猪西尼罗河热病毒(WNFV)单重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：猪西尼罗河热病毒(WNFV)单重荧光PCR检测试剂盒

产品货号：SYA417

产品规格：48次/盒|96次/盒







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名称：禽流感病毒H5亚型(AIV-H5)单重荧光PCR检测试剂盒

货号：SYA324

规格：48次/盒|96次/盒

一、简介：

本试剂盒用一对禽流感病毒H5亚型特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR技术对禽流感病毒H5亚型RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中禽流感病毒H5亚型的探针报告基团为FAM。



二、用途：

本试剂盒适用于喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各种组织样品、尿囊液及细胞培养液中的禽流感病毒H5亚型的特异性检测。适用于禽流感病毒H5亚型感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供临床参考。



三、试剂盒组成：(48T)

组份 数量 规格

禽流感H5荧光qRT-PCR反应液(H5-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管

酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管

无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管

阴性对照(NTC) 1管 50μL/管

阳性对照(H5-PTC) 1管 50μL/管



四、储存条件及有效期：

本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。



五、荧光PCR仪器适用范围：

ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。



六、样品的采集与RNA提取

6.1 样品的采集

按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。

6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。

6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。

6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。

6.2 RNA提取

可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。

6.2.1 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管，做好标识。

6.2.2 加入600μL裂解液，200μL样本，200μL氯fǎng，混匀器上振荡5 s，4℃ 12000 rpm离心15 min。

6.2.3 吸取步骤6.2.2中的上清液转移至新的无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管中(避免吸出中间层)，加入400 μL 异丙醇，颠倒混匀。

6.2.4 4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；加入600 μL 75％乙醇。

6.2.5 4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清。打开离心管管盖，室温干燥5 min-10 min。

6.2.6 加入10μL 无核酸酶水，溶解管底的RNA，5000 rpm离心5 s，-20℃保存。若长期保存需放置-80℃冰箱。

 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。



七、检测步骤：

7.1 试剂的准备

从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(H5-qRT-PCRMIX)、酶混合物(EnzymesMIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下：

试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量

荧光PCR反应液 14µL N×14µL

酶混合液 1µL N×1µL

总量 15µL N×15µL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加15μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(H5-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。

7.2 qRT-PCR反应条件

将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。

推荐循环条件:

反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min

预变性 1循环 95℃ for 10 min

PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec

60℃ for 45 sec

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。



八、结果分析

8.1 结果分析条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。

8.2 试验成立判定

(1)阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。

(2)阳性对照(H5-PTC)：均产生扩增曲线。

(3)以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。

8.3 结果判定

(1)在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明H5核酸阳性。

(2)Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明H5核酸阴性。

(3)如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。

(4)对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行H5qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明H5核酸阳性；否则判为样本阴性。



九、注意事项

(1)初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。

(2)所有使用的离心管zuì好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。

(3)PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。

(4)样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。

(5)试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。







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