WE0316 通用型免疫组化试剂盒

特别提示：包括通用型免疫组化试剂盒(鼠兔源一抗)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：通用型免疫组化试剂盒(鼠兔源一抗)

英文名称：Rabbit & Mouse HRP Kit(DAB)

产品货号：WE0316

产品规格：3ml



  本试剂盒根据生物素与链霉亲和素具有很强亲和力的原理设计。 在兔源或鼠源的一抗与相应的靶抗原结合后，本试剂盒中的生物素化抗兔/鼠通用型二抗与一抗特异结合；二抗上标记的生物素与标记了过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素结合，形成抗原～特异性一抗～生物素化的二抗～HRP标记的链霉亲和素复合物。HRP可以催化底物显色，从而推断待检抗原的存在及分布。该试剂盒使用的生物素化二抗、SA-HRP，均采用优化的标记和纯化技术，使得其染色有更高灵敏度和更低的背景，适合于检测固定石蜡包埋组织切片，以及冰冻切片、细胞爬片、新鲜制备的血涂片等。兔/鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒适合与百奥莱博即用型或浓缩型抗体配套使用。



试剂盒组成：

组份	3ml
Solution A(Endogenous Peroxydase Enzymes Blocking Buffer，White Solution)	3ml
Solution B(Normal Goat Serum For Blocking，White Solution)	3ml
Solution C(Goat anti-Rabbit/Mouse IgG，Biotin，Ready to Use，Yellow Solution)	3ml
Solution D(Streptavidin-HRP，Ready to Use，Red Solution)	3ml
DAB-A(20×)	250μl
DAB-B(1×)	5ml

注意事项：

1、以每张切片加入1滴(约50μl)计算，3ml可做60张切片， 18ml可做360张切片。

2、对于内源性生物素含量比较丰富的组织，使用本试剂盒时zuì好用内源性生物素阻断剂进行封闭。

3、DAB工作液现配现用，配制好的工作液2～8℃避光1小时内有效。

4、实验过程中避免组织片干燥，因此各步孵育时工作液用量必需充足，保证完全覆盖组织样本，且尽量在湿盒中进行孵育。

5、为获得zuì佳实验结果，请务必优化实验条件及试剂用量。

6、DAB为可疑致癌物，使用时请采取必要的防护措施。

7、本产品仅用于科研，不能用于人体反应或人体ZL。



操作步骤：

1、常规处理欲检测的石蜡或冰冻组织切片或细胞爬片等样本。

1)组织切片或细胞爬片染色前处理：

a. 石蜡切片

脱蜡水化：60ºC烤片1小时，二甲苯脱蜡二次，每次5分钟；再依次浸入梯度乙醇(无水乙醇－无水乙醇－95%－85%－75%乙醇)和蒸馏水中各5分钟水化。

b. 冰冻切片和细胞爬片

切片(或爬片)浸于0.01 M pH7.4 PBS洗涤3次×5分钟。然后用0.1%Triton X-100覆盖组织(或细胞)浸润15分钟，0.01 M pH7.4 PBS洗涤2次×5分钟。

2)石蜡切片的抗原修复：绝大大多数情况下，石蜡组织切片用柠檬酸缓冲液高压修复都是适合的。

修复工作液配制：1 L去离子水中加入10ml柠檬酸缓冲液(IHC抗原修复液, 100×)(Cat#：WE0318)，混匀即可。

修复过程：修复液加入高压锅内，待修复切片浸于修复液中(必需没过组织)，盖上压力锅盖，加热至均匀喷汽，从喷汽开始计时，1~2分钟后压力锅离开热源，自然冷却至室温，取出切片，蒸馏水淋洗后，再用PBS(0.01 M pH7.4)漂洗2次，每次3分钟。

2、滴加适量Solution A白色溶液，即内源性过氧化物酶封闭液室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。

3、滴加适量Solution B白色溶液，即封闭用正常羊血清工作液，室温孵育10分钟，甩干。

4、滴加适量一抗工作液(商品化即用型抗体或适当比例稀释的浓缩抗体)，按实验要求孵育，然后PBS充分淋洗。

5、滴加适量Solution C黄色溶液，即生物素标记羊抗兔/鼠二抗工作液，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。

6、滴加适量Solution D红色溶液，即HRP标记的链霉亲和素，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。

7、DAB显色工作液配制：根据需要量，将DAB-A和DAB-B以1：19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。也可选择每毫升试剂B中滴加1滴(约50μl)试剂A，混匀即可。

8、显色：加适量的DAB显色工作液于需要显色的组织切片或细胞爬片上即可显色，显色时间一般为1-5分钟。显微镜下观察控制显色时间，当达到zuì佳显色效果后，自来水冲洗终止显色。显色后的切片经复染、脱水透明，封片后可长期保存。



储存条件：2～8℃





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名称：包涵体微量纯化试剂盒

货号：BTN90508

规格：20次

包涵体是指超表达的蛋白在细胞胞浆内(如果超表达的是胞浆蛋白)或膜间内(如果超表达的是分泌蛋白)凝集形成的无活性的固体颗粒。包涵体形成的主要原因是在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白折叠辅助因子，或环境不适导致无法形成正确的蛋白质次级键。由于包涵体主要由超表达的重组蛋白质组成，因此分离纯化包涵体是分离纯化具有活性的重组蛋白的步。本产品就是用于快速的提取高质量的包涵体。



产品特点：

1．操作简单快速，整个过程只要三十分钟左右。

2．微量纯化，可以在1.5mL离心管中完成。

3．能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到60%以上。

4．A型用于超声法裂菌，B型用于酶法裂菌。

5．可以选择盐酸胍和尿素两种蛋白溶解方式。

6．得到的包涵体溶解液可以用于重折叠、SDS-PAGE或其他纯化处理。



试剂盒组成：

成分	20T(A型)	20T(B型)
溶液A	5ml	5ml
溶液B	50ml	50ml
包涵体溶解液	5ml	5ml
尿素	5g	5g
溶菌酶	无	600mg
Benzonase(1U/μL)	无	20μl

储存条件：常温运输和保存(B型的溶菌酶和Benzonase 需要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。



使用方法：



一、超声法裂菌(只适用于A型)

1．在蛋白诱导期结束时，转移1.5mL菌液到一个干净的塑料离心管中。zuì好同时处理不加诱导物的细菌做对照样。

2．12000rpm室温离心1分钟，小心弃上清。沉淀(约10mg)放冰上待用或放-80℃保存。

3．加入250μL 冰浴的溶液A，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则不容易沉淀包涵体。

4．直接进入第14步。



二、酶法裂菌(只适用于B型)

5．将600mg 溶菌酶全部加入到5mL溶液A中溶解，然后根据每次的需要量(一次微量提取需要250μl)分成小份放-20℃待用。每次只取用一管。

6．包涵体中的重组蛋白一般比溶解状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，如果实验发现得到的重组蛋白确有降解，则需要在溶液A中新鲜加入自备的蛋白酶YZ剂混合物(BTN80808)。

7．在蛋白诱导期结束时，转移1.5mL菌液到一个干净的塑料离心管中。zuì好同时处理不加诱导物的细菌做对照样。

8．12000rpm室温离心1分钟，小心弃上清。

9．加入250μL含溶菌酶的溶液A重悬细胞。

10．室温放置10-20分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。

11．-20℃冷冻至凝固，一定要凝固到细菌溶液变成固体为止。

12．室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的DNA 将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复冻融步，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。zuì好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

13．加入1μL Benzonase(1U/μL)，脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要30分钟左右，否则还需要延长保温时间。

14．12000rpm 4℃离心5分钟，留存上清作为SDS-PAGE 对照样品一。

15．将沉淀(包涵体)悬浮在1mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。

16．12000rpm 4℃离心10分钟，留存上清作包涵体洗涤的对照样品二。

17．将沉淀(包涵体)悬浮在1mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。

18．12000rpm 4℃离心10分钟，留存上清作包涵体洗涤的对照样品三。本产品提供的溶液B足够两次洗涤(两次洗涤一般可得到足够纯净的包涵体)。如果需要更多洗涤，用户需要单独购买包涵体洗涤液(溶液B)

19．沉淀为纯化的包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接用于包涵体溶解。



三、包涵体的溶解：

20.在包涵体沉淀中加入250μL包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡室温放置1小时使蛋白质充分溶解。注意：包涵体溶解液含6M 盐酸胍，溶解蛋白能力强于含8M尿素的溶解液，但SDS-PAGE时不能直接上样。客户也可以用本试剂盒提供的尿素干粉自配8-10 M 尿素的溶液(尿素溶液不稳定，所以不能长期放置)溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于SDS-PAGE或后续纯化。但其溶解能力弱于盐酸胍。

21. 20000g 4℃离心20分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀(未能溶解的包涵体)。SDS-PAGE 检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

22. 所得蛋白质溶液可以用于复性等试验。用户可本公司购买包涵体复性套装。



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