YT032 化学发光法生物素标记核酸检测试剂

特别提示：包括化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒

英文名称：Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit

产品货号：YT032

产品规格：1000cm2



本试剂盒是一种通过Streptavidin-HRP及后续的ECL试剂来实现化学发光检测Biotin标记核酸的检测试剂盒。适用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA等实验中，采用生物素标记的DNA或RNA探针时的检测。本试剂盒不适用于生物素标记蛋白的检测。



本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。



本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，生物素标记的DNA探针或EMSA探针的制备可以相应地使用百奥莱博的生物素标记DNA试剂盒（TdT加尾法）或EMSA探针生物素标记试剂盒(YT189)。本试剂盒可以用于检测至少10块10 x 10cm有生物素标记EMSA探针的膜，即共1000cm2。



试剂盒组份：

ECL A液	55ml
ECL B液	55ml
Streptavidin-HRP Conjugate	100μl
封闭液	380ml
洗涤液(5X)	250ml
检测平衡液	250ml

储存条件：-20℃。



使用说明：

1. 在使用Biotin标记探针的情况下，完成Southern、Northern杂交及后续洗涤后，或RPA的转膜和交联后，或EMSA的转膜和交联后，可以使用本试剂盒开始检测。下面的检测过程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜较大或较小，各溶液的用量可以按比例放大或缩小。

2. 37-50ºC水浴溶解封闭液和洗涤液。

注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50ºC之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。

3. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

4. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。

5. 去除封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

6. 取25ml 洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。

7. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。

8. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。

9. 重复步骤8三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间均约为5分钟。

10. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。

11. 取5ml ECL A液和5ml ECL B液混匀，配制成ECL工作液。注意：ECL工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。

12. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。

13. 在尼龙膜的表面小心加上步骤11配制好的共10ml ECL工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。

14. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。

15. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。



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名称：BLOTTO溶液

货号：BTN100812

规格：250mL

BLOTTO全名是Bovine Lacto TransferTechnique Optimizer，是一种含有脱脂奶粉、磷酸盐和KJ剂的杂交阻断剂，可以用于DNA杂交(Southern杂交、斑点杂交、菌落杂交)、Western杂交、ELISA；但不能用于RNA杂交和低拷贝的Southern杂交。也不能与含高浓度的SDS混用。



储存条件：低温运输、-4℃保存(不能保存在-20℃)，有效期一年。



名称：脱脂奶粉

货号：BTN130907

规格：50g

本产品为分子生物学级脱脂奶粉，可广泛用于Southern、Northern和Western印迹杂交实验的封闭试验。



储存条件：常温运输和保存、有效期半年。



名称：SSPE溶液，20×

货号：BTN100809

规格：250mL

20×的SSPE含3M NaCl、0.2M NaH2PO4、0.02M Na2EDTA，pH为7.4。它是一种在核酸分子杂交中广泛使用的溶液。其特点首先是盐浓度接近饱和，可以非常方便地稀释到不同浓度，提供不同的杂交和洗涤严谨度。其次，高盐浓度可以YZ微生物生长，便于长期放置。zuì后，它可以用于几乎所有核酸杂交试验。由于缓冲能力比SSC强，更适合于需要稳定pH的实验。



储存条件：常温运输及保存、有效期两年。



名称：超级杂交液(不含甲酰胺)

货号：BTN8091

规格：100mL

核酸杂交一般是指用一种标记的核酸探针与印迹膜上的核酸进行杂交，由此检测印迹膜上是否存在与探针同源的核酸分子(靶分子)。核酸杂交是分子生物学的基本技术之一，应用非常广泛。由于核酸杂交效率受印迹膜种类、杂交温度、探针浓度、杂交液离子强度、杂交液pH及杂交液粘度等因素影响，用户自己摸索和优化相关条件非常繁琐，因此本公司开发了本产品，其操作流程如下：





产品特点：

1. 既可用于Southern杂交(靶分子为DNA)，也可用于和Northern杂交(靶分子为RNA)，还可以用于菌落杂交，基因芯片等杂交。

2. 既可以用于同位素探针的杂交，也可以用于非同位素探针的杂交。

3. 既可以使用DNA(包括DNA Oligo)探针，也可以使用RNA探针(包括RNA Oligo)

4.含多种能够促进杂交的聚合物，使杂交反应能在6～12小时完成，而常规杂交反应一般需要12～24小时。

5.含多种封堵剂，能阻印迹膜对探针分子的非特异性吸附，能有效降低背景信号，延长曝光时间以便检测到低拷贝的RNA(Northern)和单拷贝的基因(Southern)。

6. A型不含甲酰胺，B型含50%的甲酰胺。后者使杂交在较低温度就可以完成，适合Tm 较高的分子杂交(如RNA-RNA和RNA-DNA杂交)。

7.跟各种常用的印迹膜兼容，包括硝酸纤维素膜和尼龙膜。



储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。本产品属于高盐溶液，低温下产生沉淀，必须在65℃加热溶解并充分摇匀后才能使用。



使用方法：



一、根据探针和靶分子的不同，分别按下面不同情况计算杂交分子的Tm 值

1. 对DNA-DNA杂交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L

说明：L是探针或靶分子的长度(用两者中zuì短的一个)

GC%是探针或靶分子中的GC 百分比(用两者中zuì短的一个)

Na+浓度是本产品中Na+的浓度，为0.75 M，16.6 ×log10[Na+]=(-2.07)

2. 对DNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。

3. 对RNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。

4. 对Oligo探针杂交，Tm=GC 数量×4℃+AT 数量×2℃。



二、确定zuì佳杂交温度(预杂交温度跟杂交温度应该一样)

1. 对于大于200bp的DNA-DNA杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低15-25℃，一般选择68℃。

2. 对RNA-RNA或DNA-RNA杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低15-25℃。如果这样计算出的杂交温度很高(如高于70℃)，则RNA容易降解，所以zuì好选用含甲酰胺的超级杂交液(B型本产品)，以便能在42℃完成杂交。

3. 对Oligo探针的杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低5℃。由于Oligo较短，更容易受各种因素影响(如错配率、修饰碱基比例等)，所以zuì佳温度需要适度摸索和优化。



三、确定洗膜温度

一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此条件下的zuì佳洗膜温度比Tm低5-12℃，一般情况下可以在55℃进行洗膜。Oligo探针可以室温洗膜。



四、预杂交步骤

预杂交就是用不含探针的本产品跟印迹膜进行孵育，其目的是用所含的非特异性DNA分子(鲑精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物将印迹膜上会非特异地吸附探针分子的位点封闭，否则这些位点会吸附标记的探针，造成高背景。

1. 将结合了靶分子的硝酸纤维素印迹膜或尼龙印迹膜浸泡于自备的6×SSC溶液中，使其充分湿润。

2. 将湿润的印迹膜置于一塑料杂交袋中(塑料袋zuì好预先封口，再剪掉一角，留一个小口)，按每平方厘米印迹膜加0.2mL超级杂交液的比例沿小口加入超级杂交液，然后用塑料封口机将口封牢。

3. 将此塑料袋浸没入温度设定在zuì佳杂交温度的恒温水浴中或杂交炉中，保温1-2小时，延长到12-16小时亦可。注意保温过程中塑料袋应在不停的摇动状态中，使超级杂交液与印迹膜充分接触。



五、杂交步骤

1. 如果标记的探针是双链核酸，则需经变性处理。具体操作是将探针样品在沸水浴中加热5分钟，然后迅速置冰浴中。如果是单链DNA或RNA探针，则不需变性，直接使用。

2. 将单链探针或变性后的双链探针加入到完成了预杂交的杂交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探针后用热封机封口)。探针的加入量视探针标记效率而定，一般要求终浓度不能低于1-2 ng/mL。如果检测基因组中的单拷贝基因，探针的加入量应加大，而对于检测克隆的基因片段，则探针的量可减少。如果是放射性探针，应将此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免杂交袋发生遗漏、污染工作环境。

3.在选定的杂交温度下继续保温，时间一般为6-12小时。



六、洗膜步骤。注意在下面的所有操作过程中，一定不要使印迹膜干燥。

此步是将与印迹膜非特异结合的探针分子洗去而只留下特异结合的探针分子。由于非特异性杂交的杂交分子解链温度较低，热稳定性较差，在一定的温度和较低的离子强度下，即可洗掉。

1.杂交完毕，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探针的杂交液。此含探针的杂交液可以多次使用再倒弃。

2. 剪开杂交袋，用镊子取出印迹膜，浸没于大量的2×SSC(含0.5%SDS)溶液中，室温下振荡漂洗15分钟。

3. 重复上步操作一次。

4. 将印迹膜转移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在计算好的洗膜温度下振荡漂洗30分钟至1小时。

5. 重复上步操作一次。如果是同位素标记探针，则需要重复至用盖革计数器在无核酸区域检测不出放射信号为止。

6. 将印迹膜转移到滤纸上，吸去表面液体后印迹膜即可用于后续检测。



疑难解答：

问题一：高背景(有或没有杂交信号)

解决方案：将放射性探针的比活降低到2×10E6 cpm/mL以下；将非放射性探针的终浓度降低到30 ng/mL以下；将探针长度控制在200–800 核苷酸；减少杂交时间；适当提高杂交温度。

问题二：没有杂交信号或杂交信号非常弱

解决方案：杂交过程中应应该连续振荡，不应该有气泡，避免印迹膜变干。将放射性探针活性提高到>5×10E8 cpm/ng，提高非放射性标记探针的终浓度；适当降低杂交温度。