BTN80206 两管式RT-PCR试剂盒

特别提示：包括两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)

英文名称：Two-Tube RT PCR Kit

产品货号：BTN80206

产品规格：50次



本试剂盒是整合cDNA链合成试剂和即用型PCR 试剂而得的RT-PCR试剂盒。cDNA链合成反应和PCR反应分别在两个离心管中进行。



产品特点：

1. 即开即用，足够50次RT反应(20μL体系)和600次PCR反应(30μL体系)。

2. cDNA链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT引物或基因专一引物，适合各种情况。

3. PCR试剂盒具有即用、简单等优点，PCR mix中含上样染料，所以PCR产物可以直接上样电泳。

4. 两管式操作，RT和PCR在不同试管中进行，便于单独优化RT反应或PCR反应条件。

5.扩增效率高，zuì长可扩增5Kbp以上的RNA。



试剂盒组成：

成分	规格
MMLV 逆转录酶(含RI)	100μl
RT Buffer(含dNTP)	300μl
Oligo(dT)18引物(0.5μg/μL)	50μl
随机引物(0.2μg/μL)	50μl
RNase-free 水	10ml
PCR MagicMix 3.0	9ml
专用染料	360μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。



使用方法：



一、样品RNA的制备(本试剂盒不提供相关试剂)

1、可用自本公司各种RNA提取方法提取样品的RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的RNA一定要溶解在RNase-free的超纯水中。



二：RT(逆转录)反应合成cDNA

1. 按下表配制RT反应体系(20μl体系):

RNA模板
总RNA	100-500ng
或poly(A)mRNA	10-500 ng
或专一的RNA(如体外转录制备的)	0.01pg-500ng
引物
Oligo(dT)18(0.5μg/μL)	1μL
或随机引物(0.2μg/μL)	1μL
或自备模板专一反向引物(10pmol/μL)	1-2μL
RNase-free水	补水到12μL

注意：RNA样品不能含有基因组DNA污染。随机引物与RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度(成反比)。一般情况下随机引物效率好于OligodT引物，但如果只想转录总RNA中的mRNA(只占5%左右)，则可优先选用OligodT引物，这样就可以排除非mRNA的干扰。

2. 70℃保温5分钟变性模板后立即冰浴。

3. 按顺序加入6μL RT Buffer(含dNTP)和2μL MMLV 逆转录酶(含RI)，反应终体积为20μl。

4. 42℃保温60分钟。此步为RT反应。

5. 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。

6. 合成的cDNA可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。



三、PCR(30μL体系)

1、将全部专用染料加入到PCR MagicMix 3.0中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在PCR结束后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速度。

2、在PCR 管中加入下列成分：

成份	加入量
PCR MagicMix 3.0(已加染料)	15μl
cDNA样品(上步的RT反应液)	1-5μl
模板专一性正向引物(10 pmol/μL)	1-2μl
模板专一性反向引物(10 pmol/μL)	1-2μl
补水到	30μl

注意：cDNA 也可以稀释后用作PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍完全取决于靶基因的丰度。

3、PCR反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：

过程	温度	时间
预变性	94℃	5min
PCR反应(35个循环)	94℃	1min
	55℃	1min
	72℃	2min
zuì后延伸	72℃	10min

四、电泳检测

取5-0μl PCR产物直接在PAGE或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。

注：本试剂盒中的PCR mix含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。



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