GST Pull-down实验

GST Pull-down实验

摘要：体外利用GST-PES1六种突变体蛋白（1-588aa全长，1-415aa， 322-455aa缺失，322-588aa，220-588aa，101-588aa）与His-NPM1的pull-down实验，确定PES1的220-322aa区域是与NPM1相互作用的结构域,为进一步研究PES1的功能提供实验数据。
关键词：PES1，NPM1，Pull-down， 蛋白相互作用，原核表达

一、 实验原理
利用重组技术将PES1蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合表达，融合蛋白通过GST与琼脂糖微球上结合的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，如果PES1与NPM1之间有直接相互作用，当结合了PES1蛋白的GTH微球的与含有NPM1蛋白的细胞裂解液混合孵育，再通过离心富集GST微球，得到的样品中可以检测到NPM1。

二、 实验目的
在体外检测 NPM1 (nucleophosmin )与Pes1(pescadillo)之间的直接相互作用，确定PES1与NPM1相互作用的结构域。

三、 实验步骤
1. 6×His-NPM1（pET-28a）质粒转化BL21-DE3感受态细胞
2. 培养诱导蛋白表达
1) 挑取6×His-NPM1单克隆菌落到5mL培养基（含amp抗生素）。
2) 摇床37度培养12-15h。按照1:100比例接种到50mL的培养基（含amp抗生素）。
3) 37度培养到A600吸光光度值0.6-0.8（大概2.5-3h）。
4) 加入100mM IPTG至终浓度1.0mM诱导表达。
5) 低温（30度）继续诱导培养2-4h。
6) 转移菌液到离心管，7700 g离心十min。弃去上清，在冰上控干。
7) 沉淀重悬在2.5mL PBS中。取10μL留用SDS-PAGE分析。
3. 裂解细胞
1) 加入25 μL lysozyme（10 mg/mL in H2O）。利用干冰或者液氮冻融三次。 适宜条件下超声使菌液变得澄清。
2) 12,000g 4度离心15min，上清转移到新的离心管。
4. 准备glutathione sepharose 4B beads，结合GST融合蛋白
1) 将sepharose 4B摇动后使其重悬。
2) 取 500μL sepharose 4B beads，使用10mL PBS彻底清洗3次以去除乙醇。
3) 500 g 离心5min去除上清。
4) 使用500μL PBS重悬Sepharose 4B beads。
5) 每样品取20μL Sepharose 4B beads， 加入1mL binding buffer，再加入5μg纯化的GST对照蛋白，1-588aa全长GST-PES1蛋白，1-415aa， 322-455aa缺失，322-588aa，220-588aa，101-588aa。
6) 室温混合孵育1h。
5. Pull-down 实验
1) 每样品中加入His-NMP1诱导表达裂解液100μL。
2) 4度混合过夜。
3) 500 g 离心5分种弃去上清。
4) 使用lysis buffer洗涤3-4 次。
5) 加入2x SDS上样液，煮样品10min。
6. Western Blot分析结果。使用anti-his标签抗体检测

四、 实验结果

 图1. GST-PES1各种突变体示意图

图2. GST Pull-down结果

从图2的结果可以看到，PES1的220-322aa之间的结构域是与NPM1相互作用必须的。

五、 参考文献
1. Zhang J, Yang Y, Wu J. B23 interacts with PES1 and is involved in nucleolar localization of PES1. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2009; 12: 991-997.