一步法实时荧光定量PCR检测试剂盒 EzOmicsTM One-Step qPCR Kit（适用范围：siRNA,microRNA,长片段基因检测）

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EzOmics^TM 一步法实时荧光定量PCR 检测试剂盒

货号：BK2100

产品包装：  保存于-20℃ 

EzOmics^TM 一步法qPCR检测试剂盒有100，200，500和2000次(50μl/反应) 四种不同规格的包装。 

EzOmics^TM 一步法实时定量PCR检测试剂盒，采用一步反应法完成整个RT-qPCR过程，将RNA反转录成cDNA，cDNA模板qPCR定量放在同一反应体系中进行，反应过程无需增加额外的步骤。本试剂盒具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点，即适用于SYBR Green I荧光染料法，同时也适用于荧光探针的检测方法。此试剂盒适合市面上大多数现有的Real-time PCR仪器.

反应条件及使用建议

• 反应混合体系配制建议：

建议添加无模板对照(Non-Template control，NTC) ，即添加DEPC-H2O 取代模板。

• 反转录

cDNA合成所需温度，可以在37℃～45℃进行设置，根据模板和反转录引物，选择特异性好，效率高的温度。

• 热启动DNA聚合酶

EzOmics^TM 一步法qPCR检测试剂盒中使用的是热启动Taq DNA聚合酶，在常温条件下，酶的活性受到YZ。只有通过95°C反应10 min，激活热启动酶的活性，参与下一步qPCR反应。

• MgCl2 浓度优化

MgCl2 是DNA聚合酶的一个复合因素。终浓度为3mM的MgCl2 浓度适用于大部分反应。然而，MgCl2的需求往往不尽相同，这取决于特殊的模板和引物。尤其是使用SYBR Green I荧光探针时，往往需要更高浓度的MgCl2。

建议针对合适的模板，设计3个重复反应，按下表格给的MgCl2浓度梯度。下表为50μl体系中MgCl2达到各终浓度时的需要加入的量。

根据实验结果，分析扩增效率、熔解曲线等，选择的MgCl2 浓度用于之后的相关qPCR的实验。

• 引物设计和浓度

大多数情况下，引物终浓度为200nM是能够满足PCR反应。不过，根据特殊的模板和引物，引物终浓度可以在25 ~ 900 nM范围内进行优化。引物设计可借助于实时荧光定量PCR引物（探针）设计软件（如：Beacon Designer）。为获得定量结果，产物大小Z好控制在80 ~ 200bp的范围内。

• 模板浓度

过量的模板会YZ反应的进行。通常情况下，每50μl反应体系中，总RNA含量在10ng～200ng是足够的。当然特殊的基因会有所不同。

• 探针浓度

多数情况下，引物和探针的摩尔比控制在3:1比较合适。根据实际情况，探针的浓度可在10 ~ 250 nM范围内进行优化。

• 熔解曲线分析

如果使用SYBR Green I染料法，建议在qPCR反应结束后进行熔解曲线分析，若仪器含有此功能。请参照仪器制造商推荐的使用方法说明。不含模板的阴性对照（NTC）用来确定反应过程中是否存在引物二聚体，含有模板的反应体系确定产物是否单一。
注：可以跑琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的特异性。

实验方法

• SYBR Green I 染料法

• 荧光探针法

保存和稳定性
试剂盒避光保存于-20°C。避免反复冻融。此储存条件下，试剂可保存6个月以上。


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