图二:向质粒引入单碱基(或连续多碱基)定点突变引物设计示意图 【注】:计算引物Tm值时,应计算待突变位点至引物3’端这一区域内的碱基,调整引物长度使这一段Tm值高于60℃,待突变位点至引物5’端区域内的碱基不应参与计算。 2.目标质粒扩增 2.1 配制PCR反应体系 反应各组分解冻后请充分摇匀,使用完毕后及时放回-20℃。2×HieffTM II PCR buffer请勿长时间敞口放置。 为了增加扩增特异性,反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止HieffTM II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶加入反应体系中。
ddH2O
Up to 50 μl
×TM II PCR buffer
25 μl
dNTP Mix (10 mM each) a
1 μl
模板DNA b
Optional
引物1 (10 μM)
2 μl
引物2 (10 μM)
2 μl
HieffTM II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) c
1 μl
a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。 b. 在质粒能正常扩增的前提下,应尽量减少质粒模板使用量,推荐使用≤1 ng新鲜提取的质粒做模板。 c. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。可将HieffTM II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之间进行优化,但不要超过2 U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。 2.2 PCR扩增反应 推荐PCR反应条件:
循环步骤
温度
时间
循环数
预变性
95℃
30 sec
1
变性a 退火b 延伸c
95℃ 60℃~72℃ 72℃
15 sec 15 sec 30-60 sec/kb
30 d
彻底延伸
72℃
5 min
1
a. 对于大多数质粒,变性温度使用95℃即可。 b. HieffTM II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物GX退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的Z适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。 c. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。长的延伸时间有助于提高扩增产量。 d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变,强烈建议扩增循环数≤35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数≤30。 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测。如目标质粒正确扩增,则可进行下步实验。 3.扩增产物DpnI消化,去除甲基化模板质粒 因上述扩增产物中包含原始模板质粒,为防止其在转化后形成假阳性转化子,必须在进行重组环化之前进行DpnI消化。 推荐反应体系如下:
DpnI
1 μl
扩增产物
40~50 μl
轻轻吹打混匀后,将上述反应体系置于37℃恒温反应1~2小时。如产物扩增特异,产物条带单一,DpnI消化产物无需纯化,可直接用于后续重组反应。如扩增不特异,DpnI消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物。 4.重组反应 4.1 配制重组反应体系 正反向扩增引物5’端包含完全反向互补的一段序列,因此在Exnase催化下扩增产物5’末端和3’末端可以发生同源重组,完成扩增产物环化过程。于冰水浴中,将下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘在管壁,请务必通过短暂离心使其沉入管底。体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。
图四:向质粒引入不连续双碱基定点突变引物设计示意图 【注】:计算引物Tm值时,应计算待突变位点至引物3’端这一区域内的碱基,调整引物长度使这一段Tm值高于60℃,待突变位点至引物5’端区域内的碱基不应参与计算。 2.目标质粒扩增 以待突变位点A、B为界,将质粒分为AB段和BA段。使用HieffTM II Pfu DNA Polymerase对AB段和BA段分别进行扩增。AB段扩增引物对为:待突变位点A正向扩增引物和待突变位点B反向扩增引物;BA段扩增引物对为:待突变位点B正向扩增引物和待突变位点A反向扩增引物。 2.1 配制PCR反应体系 反应各组分解冻后请充分摇匀,使用完毕后及时放回-20℃。2×HieffTM II PCR buffer请勿长时间敞口放置。为了增加扩增特异性,反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止HieffTM II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶加入反应体系中。推荐反应体系如下:
ddH2O
Up to 50 μl
2×HieffTM II PCR buffer
25 μl
dNTP Mix (10 mM each) a
1 μl
模板DNA b
Optional
引物1 (10 μM)
2 μl
引物2 (10 μM)
2 μl
HieffTM II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) c
1 μl
a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。 b. 在各片段能正常扩增的前提下,应尽量减少质粒模板使用量,推荐使用≤1 ng新鲜提取的质粒做模板。 c. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。可将HieffTM II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之间进行优化,但不要超过2 U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。 2.2 PCR扩增反应 推荐PCR反应条件:
循环步骤
温度
时间
循环数
预变性
95℃
30 sec
1
变性a 退火b 延伸c
95℃ 60℃~72℃ 72℃
15 sec 15 sec 30-60 sec/kb
30 d
彻底延伸
72℃
5 min
1
a. 对于大多数质粒,变性温度使用95℃即可。对于超过 15 kb的扩增子,变性温度降低至92℃可以提高扩增效率。 b. HieffTM II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物GX退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的Z适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。 c. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。长的延伸时间有助于提高扩增产量。 d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变,强烈建议扩增循环数≤35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数≤30。 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测。如目标质粒正确扩增,则可进行下步实验。 3.扩增产物DpnI消化,去除甲基化模板质粒 因上述扩增产物中包含原始模板质粒,为防止其在转化后形成假阳性转化子,必须在进行重组环化之前进行DpnI消化。 推荐反应体系如下:
DpnI
1 μl
扩增产物
40~50 μl
将上述反应体系置于37℃恒温反应1~2小时。如产物扩增特异,产物条带单一,DpnI消化产物无需纯化,可直接用于后续重组反应。如扩增不特异,DpnI消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物。 4.重组反应 4.1 配制重组反应体系 AB段和BA段扩增产物末端分别包含完全一致的一段序列,因此在Exnase催化下两扩增产物末端可以分别发生同源重组,完成环化过程。于冰水浴中,将下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘在管壁,请务必通过短暂离心使其沉入管底。体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。