无参考基因组的转录组测序
简介:现存物种数Z粗略范围是300万~1亿,认可范围是500万~1500万,已定名或记录的有174万种(1995年Hammond 统计)或150万种,还有大量物种没有参考基因组序列,需要我们进行研究。目前对于无参考基因组物种的转录组测序,首先需要拼接得到尽可能全面的转录本信息,这就需要选择有较长读长的测序平台,长读长能够更有效地跨越复杂基因组的高度重复区域,能够显著提高转录组组装结果,更高的组装结果将更有利于进行基因注释和基因功能的深入挖掘,使得转录本结构研究和结构变异的研究更加准确和可靠。
推荐平台:Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq和Illumina HiSeq 2000
针对无参考基因组的转录组测序,派森诺生物利用Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq和Illumina HiSeq 2000三个测序平台为您提供测序服务。其中Roche 454 FLX+测序平台的平均读长为500 bp左右,Z长可以达到1 kb,在未知基因组序列物种的转录组分析中更有优势,其较长的读长便于拼接,能获得更好的转录本数据,有利于后续进行基因注释和基因功能的深入挖掘。MiSeq平台是小型化测序仪的代表,追求的是GX率,可以为您节省项目时间,同时其测序读长目前已达到2×250 bp,长读长能够更有效地跨越复杂基因组的高度重复区域,能够显著提高转录组组装结果,同时还可进行不同样本之间的基因表达差异研究。Illumina HiSeq 2000平台追求的是高通量,单次测序获得的数据量大,这样能够得到更高的覆盖率,检测到更多低丰度的转录本,但该平台在已知基因组序列物种的转录组分析中更具优势,而且测序所需时间较长。
1、 原始数据整理、过滤及质量评估
2 、转录组测序分析
2.1 转录组拼接
2.2 Unigene聚类及GO注释
2.3 eggNOG分类注释
2.4 KEGG分类注释
2.5 Unigene的表达量分析
2.6 Unigene的表达量差异分析(样本数≥2)
2.7 差异表达的Unigene的聚类分析(热图)(样本数≥3)
2.8 差异表达的Unigene的富集分析(GO、KEGG) (样本数≥2)
2.9 cSNP分析
2.10 SSR分析
2.11 ORF分析
3、 根据客户需求进行个性化分析
1. 总RNA:针对Illumina测序平台,浓度≥80 ng/ul,总量≥12 μg;针对Roche 454 FLX+平台,浓度≥200 ng/μl,总量≥50 μg;OD260/280介于1.8-2.2之间,OD260/230值应≥2.0。电泳检测28S:18S至少大于1.5;并确保RNA无降解,无污染;或提供浓度≥50 ng/μl,总量≥1 μg的mRNA。同时,提供质量检测相关数据和图片,包括分光光度计、电泳胶图或Nanodrop仪器检测数据。一般不建议提供mRNA,较难定量。
2. 组织样品:动物、植物、微生物总量大于500 mg的新鲜样品(植物材料应尽量选取幼嫩部位)。采样后将样品立即用RNAlater和液氮速冻,保存于-80℃(保存期不超过一个月),送样时使用干冰运输(不超过72 h);提取RNA后经变性电泳,保证各RNA条带清晰、比例适中、完整性好、无降解。特别要求样品分成3份,方便后续提取,避免同一份样品反复冻融造成样品降解。
3. 细胞样品:先使用TRIzol试剂进行处理,每0.25 mL样品(5-10×106个细胞)加入0.75 mL TRIzol试剂(可参考TRIzol试剂说明书),于-80℃保存,并提供2-3份该样品。原则上不接收未经TRIzol处理的细胞样品。
4. 样品保存期间切忌反复冻融。
5. 送样管务必标清样品编号,管口使用Parafilm膜密封。
四、派森诺优势
★ 拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台,实验周期短,质量可靠。
★ 技术人员经验丰富,可以根据合作伙伴要求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。
★ 拥有适合无参考基因组的转录组测序的Illumina MiSeq、Illumina HiSeq 2000以及Roche 454 FLX+等多种高通量测序平台。
★ 拥有专业的生物信息团队和完整的生物信息分析服务体系,除提供标准化生物信息服务外,还可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务。
★ 拥有标准的、实时更新的项目进展流程,有助于合作伙伴及时了解项目进展情况。