GB-direct 血液直接PCR试剂盒（血液）

GBdirect 血液直接PCR是一种新颖的可直接从血液中扩增不同大小DNA片段的PCR试剂盒，具有适用性广和稳定性强的特点，并有效地克服了传统裂解法只能扩增小片段基因的局限性。PCR反应的DNA模板可直接来自全血，或经GBdirect Lysis Buffer处理后的血液裂解产物，用户可根据实际情况选择模板制作方式，无需提取血液基因组DNA。可用于快速血液PCR检测，STR分子标记分析及血液SNP基因分型等。GBdirect 血液直接PCR 试剂盒由Extraction Buffer、Lysis Buffer、 2x PCR Premix和HiFi DNA聚合酶所组成。

产品信息：

货号	试剂盒组分	规格	保存
GB4100-050	血液 Extraction Buffer	5 ml	4℃
	血液  Lysis Buffer	5 ml	4℃
	2X PCR Premix	0.65 ml	-20℃
	HiFi DNA聚合酶	0.1 ml	-20℃
GB4100-100	血液 Extraction Buffer	10 ml	4℃
	血液  Lysis Buffer	10 ml	4℃
	2X PCR Premix	1.3 ml	-20℃
	HiFi DNA聚合酶	0.2 ml	-20℃
GB4100-200	血液 Extraction Buffer	20 ml	4℃
	血液  Lysis Buffer	20 ml	4℃
	2X PCR Premix	2.6 ml	-20℃
	HiFi DNA聚合酶	0.4 ml	-20℃

存储条件：应避免反复冻融。有效期6个月。

 



操作流程图：






实验步骤
（一） 模板制备  
方法1：全血一步法 (适用于新鲜血液)
1. 在PCR反应管内分别加入2x PCR Premix、HiFi DNA聚合酶、PCR引物及大约5 μl新鲜血液。
2. 加入适量的ddH2O使得PCR反应体积为25 μl。
方法2：全血裂解法 (适用于反复冻融的血液)
1. 取30 μl全血于1.5 ml离心管内，加入100 μl Lysis Buffer ，涡旋混匀。
2. 37℃水浴10分钟。切勿振荡，以免造成基因组DNA的断裂。14,000 rpm 离心1分钟。上清液即可作为PCR反应所需的DNA模板。
方法3：去红血细胞法 (适用于陈旧血液)
1. 取25 μl全血于1.5ml 离心管内，加入100 μl Extraction Buffer 快速涡旋或用移液器吸头上下吸取5次。将离心管移至离心机 (注：管柄朝外放置以便离心后的沉淀位于底部的管柄方向)。14,000 rpm离心1分钟，用200 μl移液器移走上层红色液体，保留沉淀。沉淀应为粉红色或透明状。
2. 向含有沉淀的离心管中加入100 μl Lysis Buffer ，涡旋充分，确保沉淀的细胞得到完全悬浮。
3. 37℃水浴10分钟。然后14,000rpm 离心1分钟。上清液即可作为PCR反应的DNA模板。
注意
模板Z好现做现用，因为裂解后的DNA模板中除了DNA以外还含有许多其他杂质。模板可置于4℃暂时或-20℃长期保存, 但再次使用前应重新在37℃ 水浴中放置5分钟。

（三）PCR反应设置 
1. 根据（表一）设置PCR反应。若发现PCR条带出现弥散现象，建议增加DNA 模板用量；若没有PCR扩增产物，在排除其它失败原因的前提下，使用TE缓冲液对DNA 模板进行稀释，比例可为1：1或1：2（DNA 模板：稀释液），并尝试3种不同DNA模板用量进行优化，以确定稀释比例及模板用量。例如，在25 μl PCR体系中可分别加入 4 μl、5 μl、6 μl DNA模板作为优化实验条件。
      表一.  PCR反应设置：

PCR反应成分	25 μl体系
DNA 模板（μl）	5
2X PCR premix（μl）	12.5
HiFi DNA聚合酶（μl）	2
Forward & Reverse Primers  (10 μM)（μl）	0.25
ddH2O	to  25 μl

      表二.  PCR循环设定（推荐）：

温度	94℃	94℃	55-58℃	72℃	72℃
时间	5 分钟	45 秒	45 秒	1分钟/1kb	5 分钟
循环	1次	35次			1次

2. 实验结果分析：PCR 反应没有得到预期结果，参考Q/A表制定解决方案，同时建议设立阳性及阴性对照反应以发现问题所在。阳性反应可用50 ng纯化的血液DNA为模板，阴性反应以ddH2O为模板，引物可采用以前成功扩增的引物。