GBdirect 动物直接PCR试剂盒可直接萃取并扩增动物基因组DNA片段。动物组织如鱼鳍、小鼠尾/耳、肝脏、果蝇、线虫等经过GBdirect 动物Lysis Buffer处理后可直接用于PCR反应，无需提取其基因组DNA，具有操作简便、稳定性强、适用性广等优点,并有效地克服了传统碱裂法只能扩增小片段基因的局限性,因此可广泛用于快速动物组织PCR检测, STR分子标记分析等。该试剂盒由动物Lysis Buffer A、Lysis Buffer B、2x PCR Premix和HiFi DNA聚合酶所组成。
产品信息： | 货号 | 试剂盒组分 | 包装 | 保存 |
| GB4200-050 | 动物Lysis Buffer A | 5 ml | -20℃ |
| 动物Lysis Buffer B | 0.5 ml | -20℃ |
| 2x PCR Premix | 0.65 ml | -20℃ |
| HiFi DNA聚合酶 | 0.1 ml | -20℃ |
| |
| GB4200-100 | 动物Lysis Buffer A | 10 ml | -20℃ |
| 动物Lysis Buffer B | 1 ml | -20℃ |
| 2x PCR Premix | 1.3 ml | -20℃ |
| HiFi DNA聚合酶 | 0.2 ml | -20℃ |
| |
| GB4200-200 | 动物Lysis Buffer A | 20 ml | -20℃ |
| 动物Lysis Buffer B | 2 ml | -20℃ |
| 2x PCR Premix | 2.6 ml | -20℃ |
| HiFi DNA聚合酶 | 0.4 ml | -20℃ |
| |
存储条件：保存于-20℃，有效期6个月，应避免反复冻融。
特色： 1.简单快速: DNA释放仅需20 min 左右。
2.无需提取其DNA:节省时间，成本，劳动。
3.易于自动化：与高通量的基因的工作流程兼容。
4.多重PCR: 可以使用多重PCR 引物,扩增多个DNA序列。
操作流程图： 操作流程 | (一)取样 |
1. 用清水冲洗要取样的动物部位，然后用75% 酒精消毒过的干净刀片或剪刀把材料切成碎片，取一小片（相当于1-2颗油菜籽的体积）放入1.5 ml离心管中。请勿过量，不超过5 mg，过量取样会导致裂解不完全，使得基因组DNA产量减少。
2. 常见动物组织的取样标准： - 鱼组织（鳍、肉、内脏）: 2.5-5 mm3 。
- 小鼠：鼠尾≤ 2 mm、鼠耳≤ 2.5 mm2、鼠内脏≤ 5 mm3。
- 果蝇或线虫：5-10只。
3. 为防止样本间的交叉污染，每处理完一个样本后请用75%酒精清洗刀片，然后用干净的纸巾擦干残液。
| | |
(二)样本的裂解及PCR反应设置 |
|
如需同时处理大量样本, 可先将动物Lysis Buffer A 和 Lysis Buffer B 按 10:1 的比例混合，涡旋均匀，然后将100 μl混合后的 Lysis Buffer AB分别加到每个试管中。根据实验条件不同可采用以下方法：
1. 手工处理: 在含有动物样本的1.5ml离心管中加入100 μl 动物 Lysis Buffer AB，用P1000 的枪头挤压样本30次左右以捣碎动物组织，务必使组织完全破碎成糊状，然后简短离心确保样本处于裂解液中，而非贴在管壁上。或采用
自动研磨仪处理: 首先将含有动物样本和100 μl 混合后的 Lysis Buffer AB 的试管放入自动研磨仪中, 利用钢珠的撞击使核酸GX释放。
|
2.样本的裂解
60℃水浴20分钟，然后90℃水浴10分钟。 |
3.DNA模板的获得：
14,000 rpm 离心2分钟，上清液即是PCR反应所需的DNA模板。 |
| 4.PCR反应设置
表一：PCR反应设置 | PCR反应成分 | 25 μl体系 | | DNA 模板（μl） | 1 - 3 | | 2x PCR Premix（μl） | 12.5 | | HiFi DNA聚合酶（μl） | 2 | | Forward & Reverse Primers (10 μM)（μl） | 0.25 | | ddH2O | to 25 μl | |
表二：PCR循环设定 | 温度 | 94℃ | 94℃ | 58℃ | 72℃ | 72℃ | | 时间 | 5 分钟 | 45秒 | 45 秒 | 1分钟/1kb | 5 分钟 | | 循环 | 1次 | 35次 | 1次 | | |
| | | |
5.实验结果分析
1. 若直接使用未稀释的DNA模板进行PCR反应，发现没有PCR产物或PCR条带出现弥散等现象，建议首先调整DNA 模板用量。例如，使用ddH2O 或TE Buffer（自备）对裂解得到的DNA 模板进行稀释，比例可为1：1或1：2（DNA 模板：稀释液），然后在25 μl PCR体系中分别加入 1 μl、2 μl、3 μl稀释后的DNA模板作为优化条件。
2. 设立阳性及阴性对照反应以发现问题所在。阳性反应可用50ng纯化的动物DNA为模板，阴性反应以ddH2O为模板，引物可采用以前成功扩增的引物。 | |
温馨提示：不可用于临床ZL。
沪公网安备 31011502008050号
