GB-direct 植物直接PCR试剂盒

GBdirect 植物直接PCR试剂盒可直接萃取并扩增植物基因组DNA片段，而且目的基因的GC含量可高达70%以上。植物的叶、茎、根或种子干粉经过GBdirect裂解液处理后可直接用作PCR反应的模板，无需使用纯化的植物基因组DNA；具有操作简便、稳定性强、适用性广等优点；并有效地克服了传统碱裂法只能扩增小片段基因的局限性；可广泛应用于棉花、水稻、大豆、玉米、油菜和土豆等各种植物的快速PCR检测及大量转基因植株鉴定等。该试剂盒由植物Lysis Buffer A、Lysis Buffer B、2x PCR Premix和HiFi DNA聚合酶所组成。 

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产品信息

货号	试剂盒组分	包装	保存
GB4300-050	植物Lysis Buffer A	5 ml	-20℃
	植物Lysis Buffer B	0.5 ml	-20℃
	2x PCR Premix	0.65 ml	-20℃
	HiFi DNA聚合酶	0.1 ml	-20℃
GB4300-100	植物Lysis Buffer A	10 ml	-20℃
	植物Lysis Buffer B	1 ml	-20℃
	2x PCR Premix	1.3 ml	-20℃
	HiFi DNA聚合酶	0.2 ml	-20℃
GB4300-200	植物Lysis Buffer A	20 ml	-20℃
	植物Lysis Buffer B	2 ml	-20℃
	2x PCR Premix	2.6 ml	-20℃
	HiFi DNA聚合酶	0.4 ml	-20℃

产品特点：

1. 简单快速: DNA释放仅需20 min 左右。
2. 无需提取其DNA: 节省时间，成本，劳动。
3. 裂解液: 迅速、有效释放植物细胞基因组DNA。
4. 用途广泛: 适用于多种植物的叶、种子及果子干粉的基因研究。


试剂盒操作流程图：



 

实验步骤：

(一)取样：根据样本性质不同可采用以下方法 植物叶片: 用打孔器打一直径约为6 mm大小的叶片，放入1.5 ml 离心管内。 水稻根、茎: 用干净刀片将样本切碎，取一小粒（2 mm3 ，相当于1颗油菜籽的体积），放入1.5 ml离心管鲜嫩种子可参照植物根茎的处理方法；对干燥种子建议先将种子在无菌水中浸泡数小时或过夜（4℃冰箱），然后切2 mm3小粒加入到离心管内；种子研磨干粉可直接使用，但请勿超过2 mg。   注意:为防止样本间的交叉污染，每处理完一个样本后请用75%酒精清洗叶片打孔器、刀片，然后用干净的纸巾擦干残液后再使用。 (二)样本的裂解及PCR反应设置   1.样本预处理 如需同时处理大量样本, 可先将植物Lysis   Buffer A 和 Lysis Buffer B 按 10:1 的比例混合，涡旋均匀，然后将100 μl混合后的 Lysis Buffer AB分别加到每个试管中。根据实验条件不同可采用以下方法： A)手工处理: 数量不多的样本可选择用手工捣碎 方法:在含有植物样本的离心管中加入100 μl 混合后的Lysis Buffer AB，用P1000 的枪头挤压样本30次左右以捣碎植物组织，务必使叶片完全破碎成糊状，然后短暂离心确保样本处于裂解液中，避免样本贴在管壁上。或采用 B)自动研磨仪处理: 如需同时处理大批量样本 方法：首先将含有植物样本和100 μl 混合后的 Lysis Buffer AB 的试管放入自动研磨仪中, 利用钢珠的撞击使核酸GX释放。 2.裂解: 60℃水浴20分钟，然后90℃水浴10分钟。   3.获得DNA模板: 10,000 rpm离心1分钟，上清液即可作为PCR反应的DNA模板。 5.PCR反应设置: 表一：PCR反应设置 PCR反应成分 25 μl体系 DNA 模板（μl） 1 - 3 2x PCR Premix（μl） 12.5 HiFi DNA聚合酶（μl） 2 Forward & Reverse Primers  (10 μM)（μl） 0.25 ddH2O to  25 μl 表二：PCR循环设定   温度    94℃   94℃    58℃      72℃    72℃   时间 5 分钟   45秒   45 秒  1分钟/1kb  5 分钟   循环    1次 35次   1次   6.实验结果分析： 1.若直接使用未稀释的DNA模板进行PCR反应，发现没有PCR产物或PCR条带出现弥散等现象，建议首先调整DNA 模板用量。例如，使用ddH2O 或TE Buffer（自备）对裂解得到的DNA 模板进行稀释，比例可为1：1或1：2（DNA 模板：稀释液），然后在25 μl PCR体系中分别加入 1 μl、2 μl、3 μl稀释后的DNA模板作为优化条件。 2.设立阳性及阴性对照反应以发现问题所在。阳性反应可用50ng纯化的植物DNA为模板，阴性反应以ddH2O为模板，引物可采用以前成功扩增的引物。具体情况可参考下面的Q/A表制定解决方案。

使用GB-direct 植物直接PCR试剂盒成功范例：

使用GB-direct 植物直接PCR 试剂盒成功地扩展出棉花、水稻、油菜、大豆、大小麦、土豆、玉米、番茄等植物叶片中线粒体、叶绿体不同大小的基因片段，如以下实验结果图所示（部分实验结果）。实验操作过程为取一片植物叶片，用打孔器打一约6mm直径大小的叶片，放入含有100ul GB-direct 植物Lysis Buffer A-B 的1.5ml试管中，按说明书实验步骤进行基因组DNA萃取，所得含有DNA的裂解液，即植物叶片DNA模板，以1: 1或1：2 ( DNA模板：稀释液 )方式稀释，取2ul或3ul稀释后的DNA模板放入25ul PCR反应体系中，然后进行PCR循环反应扩增目的基因（稀释比例、DNA模板用量由优化实验获得）。


 棉花叶：



 
水稻叶：


 
油菜叶：



 
使用GB-direct 植物直接PCR 试剂盒不仅成功地扩展出植物叶片中大小基因，同时也适合于植物种子、果子基因的研究。以棉籽、小麦种子为例，使用GBI direct 植物直接PCR 试剂盒成功地扩展出中棉籽、小麦种子中线粒体、叶绿体不同大小的基因片段，如以下结果图所示。取一干燥棉籽或小麦种子，在无菌水中浸泡数过夜（4C冰箱），然后切5mm3小粒，放入含有100ul GB-direct 植物Lysis Buffer A-B 的1.5ml试管中，按说明书实验步骤进行基因组DNA萃取，所得含有DNA的裂解液，即棉籽（小麦种子）DNA模板，取2ul DNA模板放入25ul PCR反应体系中，然后进行PCR循环反应扩增目的基因（DNA模板用量由优化实验获得）。

棉籽：



小麦种子：


 
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