PCR-DGGE 环境微生物多样性分析

    DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 既变性梯度凝胶，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于生物学、医学等领域。一、DGGE的原理    普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE技术正是用来分离大小接近或相同的DNA片段的技术。
    DGGE是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同，从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：垂直DGGE，即变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定分离型、野生型和变异型的变性剂梯度范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。二、DGGE的发展    1979年Fisher等发明了DGGE技术用于检测DNA点突变；1983年Fisher利用DGGE技术分离仅有一个碱基之差的DNA双链；1985年Myers等首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术，是DGGE技术更加完善；1989年Sheffield首次将PCR技术和DGGE技术结合在一起，1993年Muzyer首次将DGGE技术应用分子微生物学领域的，揭示了DGGE技术在生物的遗传多样性分析方面的独特优越性，事后DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于生物，医学等领域。三、DGGE的流程 
 
四、 DGGE技术的应用
1、微生物多样性研究
    DNA选取16SrRNA或者18SrRNA基因的高变区进行PCR扩增获得目的DNA片段，通过DGGE图谱和后续的测序结果分析样本中各种微生物的种类和丰富度,可有效的获取样本中微生物的信息。
2、微生物变化的动态监测
    DGGE技术可以同时对多份样品进行分析，因此可以将来源于不同时间或空间中样品同时进行分析，通过DGGE图谱观察样本中微生物的变化情况。可用于研究环境对微生物生长的影响或是在某些特定环境中微生物的变化。
3、对于特定微生物检测
    DNA进行PCR制备成marker，在同一个DGGE图谱上通过对比样品盒mark的条带即可或许相关微生物的信息。
4、对携带特定功能基因的菌种检测
    16S或18S高变区的检测不能全面的去鉴定，那么就要通过特定功能基因的某些片段去进行菌株的鉴定或筛选。基于DGGE以上四种基本的应用，DGGE被广泛应用与各个行业的各个领域。五、DGGE技术的优缺点优点：1. GX，理论上可以分离开一个碱基差异的DNA片段。
      2. 方便，不用对样品进行标记
      3. 快速，对于已知DGGE条件的样品，可在短时间能获取DGGE图谱
      4. 直观，DGGE图谱可直观的反应出样品中个组分的丰富度
      5. 稳定，DGGE作为一种成熟的技术，可重复性高
      6. 可多样本同时分析，展现各样本的差异
缺点：1. 仅能检测样本中的主要微生物，占总量1%以上的微生物才能被检测到。
      2. DGGE只能对200-700bp的片段有效地分离，过大或者过小的片段分离效果都不是很好。
      3. 因为仪器数值有上限，对于某些某种主要菌株占比较大又要展现大部分条带的样品，通过DGGE图谱不能很好的反映出各个菌株的丰富度。
      4. 不同序列的DNA有可能发生共迁移而导致某些条带会有多种不同的DNA片段
      5. 因为某些物种的基因不同拷贝之间存在异质性，即使一个碱基的差别都会使他们分开，而导致不同的条带是相同物种。
  6. DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。
      7. 由于某些种类的16S rDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。六、 微基生物对DGGE的技术的优化1、GC-clamp
    DGGE变性胶的时候，会解链形成单链，采用一般的引物进行PCR得到的产物会完全解链形成单链；然而这种完全解链并不能很好的分离碱基相差很少的序列。通过在一侧的引物上添加一个GC-clamp，形成一个高温解链区，从而使PCR产物不完全解链；有相关的研究表明，通过添加添加GC-clamp，能更有效的分离相差很少的序列。
2、Reconditioning PCR
    DNA在PCR的扩增中会产生较多的异源双链核酸分子，在增加了GC夹后片段不完全解链，在DGGE的胶图中的某些条带可能就是异源双链核酸分子，在后期的分析会导致，该条带的分析结果不WY，通过reconditioning PCR可以减低PCR产物中的异源双链核酸分子。
3、二次DGGE
    DGGE的过程中因为共迁移而导致相同的条带中含有不同的DNA片段，通过二次DGGE将共迁移的条带分离开，从而降低因共迁移导致的误差。七、数据分析
1. 基因组DNA抽提电泳检测图
2. PCR一扩胶图3.DGGE凝胶电泳图

4.DGGE 条带分布及类型模式图


5. 生物群落多样性指数

  
6. 聚类分析图

7. 微生物群落的多维定标分析

8. Fasta格式测序结果


9.克隆子一致性分析（Alignment比对）

10. 测序结果NCBI的Blast比对


11. 测序结果的系统发育树分析
八、实验周期我们在接到客户提供的样品后，即刻进行实验，至全部实验及数据分析结束，一般控制在15-20个工作日内完成。
根据客户样本数量的不同，实验周期也不尽相同。 九、送样要求1  环境样品基因组DNA
1、）  请提供浓度大于10ng/uL，总量大于500ng的基因组DNA，DNA纯度较差或降解严重会影响后继的扩增实验。如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及OD260/280比值。
2、）  样品在保存期间避免反复冻融。
3、）  送样务必标清楚样品编号，并用parafilm膜对管口进行密封。
    请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。
2  环境样本
1、）送样样品尽量保证新鲜，为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后建议立即冰冻保存，如样本极为珍贵，建议采用液氮速冻后-80℃冰箱保存。
2、）样品在保存期间避免反复冻融。
3、）若是样品中含有大量的腐殖质酸、重金属等PCR反应YZ剂，请在送样时注明。
4、）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。 送样条件：

3  各类未抽提基因组样品的送样量：
土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、农田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
粪便：3-5 g
肠道内容物：3-5 g
动物组织：3-5g（鳃、胃粘膜、肠粘膜、口腔黏膜等）
分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、泪水等）
水样：2L以上水过滤后的滤膜，若环境中微生物丰富，可适当减少水的体积。
植物内生菌：10-20g叶片；3-5g根系。
血液:10mL。
叶片：50-100g
其他来源的样本请垂询.
PP材料的epp管或螺口管盛装即可。十、联系方式  技术咨询热线： 400-660-9270
 
     技术专家：丁博士   18918731023
 
     联系电话：021-31606760，021-31606761
 
     传真：    021-51685182
 
     E-mail：dingxu@biolinker.com
 
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