特别提示:包括二代测序DNA快速建库试剂盒(Ion Torrent平台)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床YL及其他非科研用途!
产品名称:二代测序DNA快速建库试剂盒(Ion Torrent平台)
英文名称:NGS Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent
产品货号:WE0228
产品规格:24次|96次
本试剂盒提供了构建DNA文库需要的酶预混体系及反应缓冲液,包含除接头以外的所有成分,制备的文库可用于Ion torrent PGM、Ion Proton二代测序平台的测序。和常规建库方法相比,该试剂盒将多个步骤进行了合并,省略了多个纯化步骤,因此显著降低了起始模板DNA的zuì少需求量,缩短了文库构建时间。另外,试剂盒采用高保真DNA聚合酶进行文库富集,无偏好的PCR扩增,扩大了序列的覆盖区域,可GX的制备用于Ion torrent二代测序平台的DNA文库。
试剂盒组成:
组份 | 24次 | 96次 |
10×End Repair Buffer | 200μl | 800μl |
End Repair Enzyme Mix | 48μl | 192μl |
Ligation and Nick Repair Buffer | 400μl | 2×800μl |
T4 DNA Ligase | 48μl | 192μl |
Bst DNA Polymerase | 48μl | 192μl |
2×HiFidelity PCR Mix | 600μl | 2×1.2ml |
10×Primer Mix(5μM each) | 150μl | 600μl |
自备仪器、试剂和耗材:
1、磁力架:建议使用Life公司磁力架。
2、DNA纯化回收试剂盒:建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(WE0205)。
3、样本接头引物试剂盒。
4、无水乙醇,EB(10 mM Tris-HCl, pH 8.0),去离子水(pH 在7.0-8.0之间)。
5、反应管:建议使用低吸附的PCR管与1.5ml离心管;枪头:建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染。
实验前准备及重要注意事项:
1、避免试剂盒中Buffer的反复冻融,建议首次使用时将Buffer进行分装保存。酶在使用完应尽快放回-20℃保存,
2、PCR产物因操作不当极易产生污染,导致实验结果不准确,建议将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离,并使用专门的移液器,定期对各实验区域进行清洁。
DNA建库流程示意图:起始材料:5ng-1μg打断的双链DNA,溶于EB(10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中,DNA纯度要求:OD260/OD 280=1.8-2.0。
DNA末端修复反应:1、向200μl PCR管中加入以下成分,用枪头将上述溶液轻轻混匀,瞬时离心使所有组分收集到管底。
试剂 | 体积 |
10×End Repair Buffer | 6μl |
End Repair Enzyme Mix | 2μl |
fragmented DNA | X(10ng~1μg) |
RNase-Free Water | Up to 60μl |
2、将管子置入PCR仪中,热盖打开,反应程序如下:
20 min @ 25℃
10 min @ 70℃
Hold on 4℃
Adaptor 连接:建议使用百奥莱博adaptor进行连接,也可选择使用Life、Kapa公司的adaptor,具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用百奥莱博adaptor进行连接的
操作步骤:
1、向上述反应液中直接加入以下试剂, 用枪头将上述试剂混匀,短暂离心,使溶液收集到管底。
试剂 | 体积 |
Ligation and Nick Repair Buffer | 10μl |
T4 DNA Ligase | 2μl |
Bst DNA Polymerase | 2μl |
Adaptor A | 7μl |
Adaptor P1 | 7μl |
RNase-Free Water | 12μl |
Total volume | 40μl |
注意:建议Adaptor的加入量与DNA片段的摩尔比为10:1-20:1,具体Adaptor的使用浓度请参照下表。如果DNA量为10-100ng, adaptor建议使用浓度为1μM(小于260 bp)或 0.5μM(300-400 bp)。
插入DNA 量/反应 | 不同大小DNA 建议Adaptor 使用浓度 |
130 bp | 260 bp | 320 bp | 410 bp |
1μg | 10μM | 10μM | 5μM | 5μM |
500ng | 5μM | 5μM | 2.5μM | 2.5μM |
100ng | 1μM | 1μM | 0.5μM | 0.5μM |
2、反应步骤:
15 min @ 25℃
5 min @ 65℃
Hold on 4℃
Adaptor连接DNA片段的选择性回收: 构建不同大小的DNA文库时,需进行DNA片段的选择性回收。若起始样本量低于50ng,不建议进行DNA片段选择性回收。可参考另一种方案,直接进行DNA片段的纯化。建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(WE0205)进行DNA片段选择性回收。若使用除百奥莱博以外厂家的磁珠,需自行摸索zuì佳磁珠用量。以下
操作步骤采用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒,可选择回收DNA片段长度范围为310-370bp(读长为200bp),反应起始体积为100μl。
1、涡旋振荡MCPure 20秒,使其彻底混匀为均一溶液;
2、将100μl adaptor连接反应缓冲液转移至一新的1.5ml离心管中;
3、加入60μl混合均匀的MCPure,涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟;
4、短暂离心,将离心管置于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心地将上清溶液转移至新的1.5ml离心管中,并弃去磁珠;
注意:不要弃除上清。
5、向上清中加入20μl混合均匀的MCPure,涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟;
6、短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心移取上清并弃除,期间避免接触结合目标DNA的磁珠;
注意:不要弃除磁珠。
7、继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μl新配置的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清;
8、重复步骤7;为彻底移除残留液体,可将离心管短暂离心后,再次移除残留液体。
9、保持离心管固定于磁力架上,室温静置5分钟,使磁珠在空气中干燥;
10、将离心管从磁力架上取下,加入25μl 10 mMTris-HCl(pH 8.0)或去离子水(自备),涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟;
11、短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将25μl洗脱液转移至一个新的PCR管中;
另一种方案:Adaptor连接DNA片段的全部回收:1、涡旋振荡MCPure20秒,使其彻底混匀为均一溶液。
2、将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure,涡旋震荡5秒钟后,室温静置5分钟。
4、短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心吸取上清并弃除,期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意:不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清。
6、重复步骤5。为彻底移除残留液体,可将离心管短暂离心后,再次移除残留液体。
7、保持离心管固定于磁力架上,室温静置5分钟,使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下,加入25μl EB(自备)或去离子水,涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟。
9、短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将25μl洗脱液转移至一个新的PCR管中。
PCR富集:1、在PCR管中加入以下试剂并混匀:
试剂 | 体积 |
连接adaptor后的DNA片段 | 20μl |
2×HiFidelity PCR Mix | 25μl |
10×Primer Mix(5μM each) | 5μl |
总体积 | 50μl |
2、PCR反应条件:
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 98℃ | 30s | |
变性 | 98℃ | 10s | 4~12个循环 |
退火 | 65℃ | 30 s |
延伸 | 72℃ | 30 s |
终延伸 | 72℃ | 5min | |
注:样本量为1ug时,4-6个cycles,样本量100ng时6-8个cycles,样本量为10ng时10-12个cycles。PCR循环数可根据实验进行优化。
PCR产物的纯化:1、涡旋振荡MCPure20秒,使其彻底混匀为均一溶液;
2、将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中;
3、加入1倍样品体积的MCPure,涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟;
4、短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟)。小心移取上清并弃除,期间避免接触结合目标DNA的磁珠;
注意:不要弃除磁珠
5、继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清。
6、重复步骤5;为彻底移除残留液体,可将离心管短暂离心后,再次移除残留液体。
7、保持离心管固定于磁力架上,室温静置5分钟,使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下,加入25μl EB(自备)或去离子水,涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟,短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将25μl洗脱液转移至一个新的PCR管中,DNA文库在-20℃保存。
储存条件:-20℃
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温馨提示:不可用于临床ZL。