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名称:热启动高保真酶现货供应
品Pai:百奥莱博
产地:国产|进口
规格:100U
英文名:HotStart Pfu DNA Polymerase
HotStart Pfu DNA Polymerase在Pfu DNA Polymerase的基础上添加了在常温下能够YZ5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体,可进行高特异性的热启动(Hot Start)PCR,扩增产物为平端。Pfu DNA Polymerase是经过基因工程改造的,新一代超保真DNA聚合酶,具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性,可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升,即使是非常复杂的模板,也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/52,是Pfu酶的1/6;且扩增速度可以达到15秒/kb。
本产品中附带的5×HS Pfu buffer对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+ (1×终浓度为2 mM),可以使用产品中提供的DMSO/MgSO4对反应体系进行优化。另外,产品中附带的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。
产品组份:
5×HS Pfu buffer(with 10 mM MgSO4):1.25 ml
25 mM MgSO4:1 ml
dNTP Mix(10 mM each):100 μl
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl):100 μl
5×PCR Enhancer:500 μl
DMSO:100 μl
10×Loading buffer:1.25 ml
活性定义:用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,74℃ 30分钟内,摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位(U)。
储存条件:-20℃
质量控制:
核酸外切酶残留检测:10 U本品和0.6 μg λ-HindⅢ在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测:10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中,加入2U本品,以ddH2O为模板,扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,无扩增条带。
功能检测1:50 μl PCR体系中加入1U本品,以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2:50 μl PCR体系中加入1U本品,以10 ng λDNA为模板扩增30个循环,取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的15 kb条带。
使用方法:
1. 所有操作请在冰上进行,各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HS Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶ZH加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5×HS Pfu buffer请勿长时间敞口放置。
ddH2O | to 50 μl |
d5×HS Pfu buffer (with 10 mM MgSO4) | 10 μl |
d25 mM MgSO4a | optional |
ddNTP Mix(10 mM each)b | 1 μl |
dDMSOc | optional |
d5×PCR Enhancerd | optional |
d模板DNAe | optional |
dForward Primer(10 μM) | 2μl |
dReverse Primer(10 μM) | 2 μl |
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)f | 1 μl |
【注】:
a. 对于大多数PCR反应,Mg2+ZJ终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+,如有需要,可用25 mM MgSO4,以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+ZJ使用浓度。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 扩增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。
d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用;可能会降低保真度。
e. 不同模板ZJ反应浓度有所不同,下表为50 μl反应体系推荐模板使用量:
模板种类/扩增长度 | <1 kb | 1 kb~10 kb | >10 kb |
基因组DNA | 50 ng~250 ng | 100 ng~300 ng | 150 ng~400 ng |
质粒或病毒DNA | 10 pg~20 ng | 10 pg~20 ng | 1 ng~30 ng |
cDNA | 1~5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10) |
f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而,根据扩增子的长度和复杂程度不同,可将HS Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。HS Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆,加A之前必须进行DNA纯化。
2. 推荐PCR反应条件:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性a | 95℃ | 30 sec~3 min | 1 |
变性b | 95℃ | 5~10 sec | 25~35循环 |
退火c | 45℃~72℃ | 10~30 sec |
延伸d | 72℃ | 15~30 sec/kb |
彻底延伸 | 72℃ | 5~10 min | 1 |
【注】:
a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃,时间为:质粒或病毒DNA,30 sec,基因组2 min,cDNA 3 min;对于高GC含量模板,预变性温度需提升至98℃,变性时间为2~4 min;对于超过10 kb的扩增子,预变性温度需降低至92℃,变性时间不超过2 min。
b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5~10 sec即可。对于高GC含量模板,变性温度需提升至98℃;对于超过10 kb的扩增子,变性温度需降低至92℃,并延长变性时间至15 sec。
c. HS Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物GX退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此,推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板,退火时间可在10~30sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段,需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时,可使用15 sec/kb的延伸时间;使用基因组
cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时,延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加,因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。
3. 长片段PCR指南:
*使用高质量的模板;
*使用长引物。将引物加长至Tm值68~72℃,把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性;
*适当提高酶量,但50μl反应体系内不要超过2 U;
*添加DMSO,以1%的浓度递增。调整范围为0%~6%;
*推荐反应条件设置:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 92℃ | 2 min | 1 |
变性 | 92℃ | 5~10 sec | 25~35循环 |
延伸 | 68℃ | 15~30 sec/kb |
彻底延伸 | 68℃ | 5~10 min | 1 |
4. 高GC含量模板PCR指南:
*使用高质量的模板;
*提高变性温度至98℃;
*添加DMSO,以1%的浓度递增。调整范围为0%~8%;
*添加5×PCR Enhancer;
*推荐反应条件设置:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 98℃ | 3 min | 1 |
变性 | 98℃ | 10 sec | 25~35循环 |
退火 | 45℃~72℃ | 10~30sec |
延伸 | 72℃ | 15~30 sec/kb |
彻底延伸 | 72℃ | 5~10 min | 1 |
引物设计注意事项:
1)引物3’端ZH一个碱基为G或者C;
2)引物3’端ZH8个碱基应避免出现连续错配;
3)引物3’端尽量避免发夹结构出现;
4)引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5)引物额外附加序列,即与模板非配对序列,不应参与引物Tm值计算;
6)引物的GC含量控制在40%-60%之间;
7)正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
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温馨提示:不可用于临床ZL。