超纯RNA提取试剂盒(DNase I) RNA纯化

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名称：超纯RNA提取试剂盒(DNase I) RNA纯化
品Pai：百奥莱博
规格：50次
产地：国产|进口
编号：WE0193
英文名：SuperPure RNA Extraction Kit(DNase I)
  本试剂盒是基于TRIzon改进后的柱式总RNA提取试剂盒，本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中提取总RNA。首先裂解液充分裂解并匀质化样本，在特有的高盐状态下，RNA特异性地与硅基质结合，在极大程度减少了蛋白污染的同时有效去除了有机溶剂的污染，得到的RNA纯度更好，质量更高。本产品可从各细胞或组织中快速提取总RNA，每次可处理 30-50 mg组织或 5×106 细胞，可同时处理多个不同样品。如果是对微量DN非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除，提取后的RNA可直接应用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。

试剂盒组成：

组份	50次
DNase I	1000 U
10×Reaction Buffer	1000μl
TRIzon Reagent	60ml
Buffer RW1	40ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
吸附柱RM及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

保存条件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，TRIzon Reagent 2～8℃避光保存，其它组分室温(15～30℃)。

自备试剂：*仿(新开封或提取RNA专用)、70%乙醇(无RNase水配制)、无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)配制溶液应使用无RNase的水。
3)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、样品应避免反复冻融，否则影响RNA提取得率和质量。
3、使用前若发现TRIzon Reagent有沉淀，可置于56℃水浴几分钟，即可溶解。
4、DY次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5、所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤：
1、样品处理
① 组织：30-50 mg组织在液氮中充分研磨后加入1ml TRIzon Reagent，或在组织样品中加入1ml TRIzon Reagent后匀浆处理。
注意：样品体积不超过TRIzon Reagent体积的10%。
② 单层培养细胞：吸去培养液，加入适量 ，每10cm2加入1ml TRIzon Reagent。
③ 细胞悬液：离心收集细胞。每5×106细胞加入1ml TRIzon Reagent。
2、样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3、以每1ml TRIzon Reagent加入200μl*仿的比例加入*仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。
4、4℃ 12000rpm(~～13400×g)离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。
5、在得到的水相溶液中加入等体积的70%乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。
6、将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、配制DNase I 混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混匀， 配制成终体积为80μl的反应液。
9、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。
10、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
11、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
12、重复步骤11。
13、12000rpm离心2 分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)。
14、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：
1)RNase-Free Wate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量，可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤14。
3)如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤14。

储存条件：室温(15～30℃)。

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·游离DNA样本保存管(5ml)
编号：WE0396
英文名称：Cell-Free DNA Storage Tube(5ml)
规格：5ml×5支|5ml×50支
游离DNA保存管可直接用于血样的采集与运输，并稳定其中的游离DNA(Cell-Free DNA)，是由EDTA抗凝剂和特殊的保护剂组成，能够有效YZ血浆中的核酸酶，并避免血液有核细胞中基因组DNA的释放。该产品适用于无创产前筛查与一些疾病的早期诊断相关的研究。
游离DNA保存管中血液样本可按大多数商业化试剂盒进行游离DNA提取，提取后的游离DNA可应用于下游的检测与分析。同时，该产品也能够用于血液有核细胞中的基因组DNA的保存。

·蛋白印迹膜再生液
编号：WE0304
英文名称：Stripping Buffer
规格：100ml|500ml
  本产品采用温和洗涤配方，可在不影响目的蛋白的情况下，去除结合在印迹膜上的一抗和二抗，使同一张膜可进行多次抗体检测，无需反复电泳和转膜，节省样品和时间，适用于使用NC或PVDF膜进行Western Blot检测时条件的优化或同一样品不同蛋白的检测。

注意事项：建议先检测表达量较低的目的蛋白，用再生液处理后检测表达量高的蛋白，如内参蛋白等。

操作步骤：
1、将曝光后的膜取出，加入适量的Stripping Buffer(蛋白印迹膜再生液)，再生液充分覆盖膜表面，8.5 cm×5.5 cm膜加入15ml左右蛋白印迹膜再生液，室温振摇孵育15分钟左右(孵育时间应根据不同的目的蛋白来调整：比如内参抗体等表达量较高的蛋白，使用蛋白印迹膜再生液时可以延长孵育时间至1小时或者在37℃孵育30分钟)。
2、弃去蛋白印迹膜再生液，用15ml缓冲液(PBST或TBST)洗膜3次，每次5 分钟，室温振摇。
3、为了检测酶标二抗洗脱是否完全，此时可以用显色方法来确定二抗是否洗脱掉。
4、待检测完毕，确认膜上无残留的酶活性，再生后的膜通过加入15ml的封闭液进行封闭，室温30分钟或者4℃封闭过夜。
5、重新加入待测一抗，进行下一轮的WB实验。

储存条件：室温


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·新型固定组织基因组DNA提取试剂盒
编号：WE0172
英文名称：NewPurify FFPE DNA Extraction kit
规格：50次
  本试剂盒适用于从固定、石蜡包埋组织中有效纯化基因组DNA。本品使用专门优化脱蜡剂和裂解液，释放固定或组织切片样本中的DNA，不涉及有机试剂二甲*，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除游离DNA的交联，有效提高DNA的产量和纯度；优化的缓冲系统使裂解液中的DNA可特异结合到吸附膜上，YZ剂通过两步漂洗步骤有效去除，ZH使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。同时配置GX微量吸附柱，洗脱体积可低至20μl。经过纯化的DNA可以直接用于PCR、Real-time PCR、SNP基因分型、STR基因分型、二代测序和药物基因组学研究等。
  从固定、石蜡包埋样本中分离的DNA分子量通常低于新鲜或冷冻样本中的DNA。DNA片段化的程度取决于样本类型、储存时间以及固定的条件。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer GTL	15ml
Buffer GL	15ml
Buffer GW1(浓缩)	13ml
Buffer GW2(浓缩)	15ml
Buffer EB	10ml
Buffer DS	10ml
蛋白酶K	25 mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml
离心吸附柱DF及收集管	50套
离心管(L-1.5ml)	50个

自备试剂：无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的中固定，固定时间以14-24小时为宜，时间过长易导致基因组断裂，影响下游实验。如果甲醛固定时间过长或样本存放时间过久(＞1年)则易导致DNA完整性受损，无法扩出长片段。
2、确保包埋前的样品彻底脱水，残留的会YZ蛋白酶K 的作用。
3、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，以免影响其活性。
4、DY次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
5、使用前请检查Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS于56℃水浴重新溶解。
6、如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入2μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A本试剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购，货号：WE0225S。
7、实验开始前将水浴锅或恒温混匀仪预热至56℃。

操作步骤：

石蜡包埋样本
1、用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织后切成5-10μM的薄片。
2、取约1×1cm2的切片(共约3-8片切片)置于离心管(自备)中，加入160μl Buffer DS，涡旋震荡10秒。短暂离心将样本收集到管底。56℃孵育3分钟，水浴锅中取出后静置，降至室温后进行下一步操作。
注意：如果样品表面暴露在空气中，最初的2-3片弃掉不用。
3、上述管中加入180μl Buffer GTL，涡旋震荡混匀，12000rpm离心1分钟，溶液分为两层。取20μl 蛋白酶K 加入到下层溶液中，移液器小心吹吸混匀。
4、56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。90℃孵育1小时。12000rpm离心1分钟，使用200μl枪头沿管壁小心吸取下层的水相于新的离心管中。
注意：
1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成DNA断裂，产生DNA碎片。
2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。
3)如需除去RNA，可将样品温度降到室温后，加入2μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置2分钟。

等固定液中的样本
1、取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μl 10mM PBS(PH7.4)，涡旋振荡，12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，弃上清，重复3次。
2、上述管中加入180μl Buffer GTL，20μl 蛋白酶K ，涡旋震荡混匀。
3、56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。90℃孵育1小时。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成DNA断裂，产生DNA碎片。
2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。
4、12000rpm离心1分钟，使用200μl枪头沿管壁小心吸取上清到新的离心管中。
注意：如需除去RNA，可将样品温度降到室温后，加入2μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置2分钟。
5、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀后加入200μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即充分混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
3)如果需要对多个样品进行操作，可以将Buffer GL和无水乙醇事先混匀后加样。
6、将步骤5所得溶液全部加入已装入收集管的吸附柱DF中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。
9、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应。
10、将吸附柱置于一个新的1.5ml收集管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-100μlBuffer EB或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。

储存条件：室温(15～30℃)。

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