全外显子组测序-欧易生物

全外显子组测序

全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，可发现与蛋白质功能变异相关的基因突变。外显子组约占基因组的1-2%，却包含约85%的致病突变。与全基因组测序相比，全外显子组测序检测目标区域明确，更加经济GX，对研究SNP、InDel等具有较大的优势，可以凭借高深度测序鉴定到全基因组测序所没有鉴定到的突变。

技术原理

全外显子捕获技术平台是以生物素标记的寡聚核苷酸为探针，与片段化后的基因组DNA文库杂交，通过碱基互补配对与外显子区域结合，再用链霉亲和素磁珠纯化将目标区域拉下来进行富集，然后进行测序（如下图所示）。

欧易特色

Agilent长期官方合作伙伴和质量保证，基于SureSelect平台开展服务

确保一对一捕获，全程原装配套试剂

拥有丰富的FFPE、ctDNA、显微切割等特殊样本处理经验

具备成熟稳定的微量或低起始量DNA（10 ng）建库测序技术

采用Illumina测序平台保证数据的可靠性和分析的准确性

提供常规和高级信息分析，可根据客户需求提供个性化数据分析和作图

根据客户研究目标灵活制定研究方案

从样本提取到文章发表，提供一站式贴心服务支持

应用领域

全外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的基因编码区变异，结合大量公共数据库提供的外显子组数据，有利于更好地解释基因变异和疾病之间的关联及致病机理。特别适合大样本量进行高深度测序，可发现低深度难以发现的基因变异，非常适合肿瘤研究，同时在其他疾病研究领域也应用广泛。

捕获平台
Agilent SureSelect Human All Exon V6/V7/ Clinical Research Exome V2
Agilent SureSelect Non-Human All Exon (Mouse/Bovine/ Zebra?sh/ Canine)

测序平台
 HiSeq X-Ten，PE150

数据分析

欧易生物全外显子组测序数据分析内容丰富，覆盖全面，可挖掘大量的突变数据信息

满足高频突变统计、高频突变基因通路富集、驱动基因筛选、CNV分布等分析需求

分析流程

测序下机获得原始测序数据（Raw Data）后，进入生物信息分析流程，共有两个阶段

测序数据质量评估

主要通过对测序错误率，数据量，比对率，覆盖度等进行统计

评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续分析

变异信息分析

将高质量的测序序列比对到人的参考基因组上，检测样本中的变异信息

对于癌症配对样本（Tumor/Normal）检测体细胞突变（Somatic Mutation），并对检测到的变异信息进行分析解读

 案例展示

案例一   浆细胞样膀胱癌中体细胞突变研究

研究背景

膀胱癌是世界范围内的第九大常见癌症，同时也是男性中第四大常见癌症。虽然TCGA数据库中包含了丰富的膀胱癌的资料，但其形态学与预后异质性的分子机理还不是很明确。

研究内容与结果

该研究采用全外显子组测序并结合TCGA数据库，对6例浆细胞样膀胱癌组织样本进行序列分析，发现均存在CDH1基因（该基因编码产物为E-cadherin）的无义突变，而在TCGA数据库中的其他127例膀胱癌患者中均不存在CDH1基因的truncating 突变。另取19例浆细胞样膀胱癌组织样本进行全外显子组测序，14例患者中存在CDH1突变；选择62名患者进行序列及组织学分析，6名组织学上鉴定表现为浆细胞性癌症的病人中均检测出CDH1突变，而在剩余的56名非浆
细胞性癌症的患者中均没有检测到CDH1突变。

利用免疫组化验证浆细胞性癌症中CDH1的基因突变可造成E-cadherin蛋白的表达缺失。ZH利用CRISPR-Cas9技术敲除尿路上皮肿瘤细胞中的CDH1，细胞的迁移能力显著增强

膀胱癌中CDH1的突变频率与分布比较

参考文献

Al-Ahmadie H A,et al.Frequent somaticCDH1loss-of-function mutations in plasmacy-toid variant bladder cancer.Nature genetics. 2016, 48: 356-358. 

案例二   高血压发病新机理研究

研究背景

醛固酮过多是导致心肌肥厚、心力衰竭和肾功能受损的重要危险因素。醛固酮增多症会导致严重的继发性高血压，从基因水平探讨醛固酮增多症的致病机理可为高血压的JZZL提供理论支持。

研究内容与结果

这两项研究均采用全外显子测序方法，发现并阐明了氯离子通道编码基因CLCN2的突变对醛固酮增多症导致的继发性高血压的影响，揭示了导致醛固酮增多症的一个遗传因素。在DY项研究中，通过对一个醛固酮增多症家族进行全外显子组测序，发现位于3号染色体上控制氯离子通道的编码基因CLCN2在醛固酮增多症患者体内发生了杂合突变，而在无醛固酮增
多症的个体中没有出现该突变。将测序结果与细胞实验结合在一起，分析发现醛固酮增多症与CLCN2基因突变存在极大地联系， CLCN2基因突变会增加肾上腺肾小球细胞膜去极化，从而促进醛固酮的产生。此研究阐明了醛固酮增多症导致继发性高血压的机制，为疾病的治愈提供新思路。

CLCN2基因突变图谱

 CLCN2基因突变功能模式图

在第二项研究中，通过对十几个醛固酮增多症和高血压患者进行全外显子组测序，发现至少一个CLCN2突变与醛固酮增多症之间存在关联。通过对一个有醛固酮增多症患者的家庭进行全外显子测序，发现了一个新的生殖细胞CLCN2突变，该患者9岁时被诊断患有醛固酮增多症，且是杂合子，但是在其兄弟姐妹和父母的基因序列，以及现有的序列数据库中均未发现该突变型。在另外11名醛固酮增多症患者的基因序列中并未发现其他CLCN2新突变。 但是，当跟踪表达CLCN2的非洲爪蟾卵细胞中的离子电流时，发现氯离子通道的活性增强，可能是由于CLCN2区域的功能增益变化而产生的，而该区域通常保持过度去极化。随后在人类肾上腺皮质细胞系中发现的表达模式进一步支持了该研究结果。本研究中氯通道参与原发性醛固酮增多症以及CLCN2突变的发现，为高血压的的发病机理及ZL开辟了全新的领域。

CLCN2基因突变鉴定及与临床特征的关系

参考文献

1. Scholl UI,et al.CLCN2 chloride channel mutations in familial hyperaldosteronismtype II.Nature genetics. 2018, 50(3): 349-354.
2. Fernandes-Rosa FL,et al. A gain-of-function mutation in theCLCN2chloride channel gene causes primary aldosteronism.Nature genetics. 2018, 50(3): 355-361.