BACE1是是阿兹海默症病理学中的关键酶,催化Aβ蛋白形成,在阿兹海默病人的样品中表达量上升。BACE1基因DNA反义链上转录形成LncRNA BACE1-AS. 细胞和活体实验证明 BACE1-AS具有调控BACE-1 mRNA稳定性的功能,因此能促进BACE-1蛋白的表达。准确检测BACE1-AS的表达量,是研究该LncRNA分子功能的关键。链特异性地RT反应,仅将靶标转录本(BACE1-AS)反转录成cDNA, 排除了反义链转录本带来的干扰。
*图释: 在RT步骤中选用链特异性地引物,仅检测BACE1-AS。
康成生物LncRNA实时定量PCR技术服务流程
1. 引物设计、合成及测试
a. 从权威数据库(Refseq, UCSC known gene, ensemble, 相关文献)中得到非编码RNA的序列,屏蔽SNP及重复序列。
b. 在引物设计软件中,调整引物的设计位点,将引物设计在转录本特异的区域,如: exon-exon的连接点附近。然后根据PCR的反应条件,优化引物参数,如 Tm值,产物大小,二级结构,引物二聚体等。
c. 通过和数据库blast比对,降低引物非特异性扩展的可能性。
d. 通过实验对引物的扩增效果进行测试。
2. 样品RNA抽提及RNA质量检测
a. 紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值,获得RNA的浓度并通过 A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
b. 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
3. 逆转录合成cDNA
利用链特异性的反转录引物进行RT反应,合成cDNA。
4. 实时定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增。同时检测每个样品中内参基因的表达量,校正上样误差。
5. 分析结果、提供实验报告
分析实时定量PCR结果,提供实验报告,包括详细的实验方法,实时定量PCR实验数据和图表。
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