LncRNA实时定量PCR技术服务

LncRNA是目前生命科学以及医学研究领域中的研究热点之一。由于LncRNA具有一些重要的分子特征，在进行实时定量PCR检测的时候需要更为精细的实验设计:     可变剪接：大部分的LncRNA在成熟过程中，经过剪接步骤。一些LncRNA在这个过程中形成剪接异构体，这些异构体的表达具有组织特异性，其中部分具有不同甚至相反的生物学功能，因此需要对LncRNA进行转录本特异的检测。 长链反义非编码RNA（long antisense ncRNA）：大约50%的蛋白编码基因的基因组区域能够转录形成长链反义非编码RNA. 这些RNA分子转录方向和蛋白编码基因相反，没有蛋白编码能力，是LncRNA的重要组成部分。 sense转录本和antisense转录本可能具有不同的生物学功能，然而基于oligo（dT）或随机引物的标准RT-PCR方法缺乏链特异性，不能将两种转录本进行有效区分，得到的数值是两个转录本的总表达量。   虹舜生物为您提供lncRNA-qPCR技术服务，您只需要提供保存完好的标本及标本信息，虹舜生物就可为您完成lncRNA-qPCR实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告。   LncRNA-qPCR技术服务流程： 1. 引物设计、合成及测试     a. 从权威数据库（Refseq, UCSC known gene, ensemble, 相关文献）中得到非编码RNA的序列，屏蔽SNP及重复序列。     b. 在引物设计软件中，调整引物的设计位点，将引物设计在转录本特异的区域，如： exon-exon的连接点附近。然后根据PCR的反应条件，优化引物参数，如 Tm值，产物大小，二级结构，引物二聚体等。     c.  通过和数据库blast比对，降低引物非特异性扩展的可能性。     d. 通过实验对引物的扩增效果进行测试。 2. 样品RNA抽提及RNA质量检测     a． 紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过 A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。     b． 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。 3. 逆转录合成cDNA     利用链特异性的反转录引物进行RT反应，合成cDNA。 4. 实时定量PCR     以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增。同时检测每个样品中内参基因的表达量，校正上样误差。 5. 分析结果、提供实验报告     分析实时定量PCR结果，提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。 数据展示: 扩增曲线(AmplificationCurves)熔解曲线(Melting Peaks)

 LncRNA-qPCR样品准备：
一、动物组织样品保存与运输
1、新鲜组织样品的保存与运输
A、使用RNAlater试剂
® 取新鲜组织（注：生物体死亡后尽快在10分钟内取材），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在0.5 cm以下（长宽不限），然后放入装有5倍体积RNAlater的离心管（或冻存管）中。
® 4℃孵育过夜，此时样品管需要横置以便组织块充分接触到RNAlater，然后转入- 20℃中保存。样品在- 20℃不会冻结，但是溶液中可能有一些晶体出现，这并不影响后续的RNA抽提。冻存样品也可以反复冻溶，其RNA含量和完整性不受影响。
® RNAlater处理的标本可用常规冰袋4℃低温运输（无需使用干冰- 70℃运输）。
B、使用Trizol试剂
Trizol试剂可YZRNA酶活性，破坏细胞膜结构以裂解细胞释放出RNA。
® 取新鲜组织（注：生物体死亡后1分钟内取材料并保存好），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，每50~100 mg组织加1 ml Trizol溶液匀浆裂解组织样品，操作Z好在冰上进行。
® 匀浆的裂解液4℃短期保存（1个月），-20度或- 70℃长期保存。干冰运输，短期（5天以内）冷藏（4℃）运输亦可。
2、冻存组织的保存与运输
生物体死亡后尽快（Z好在10分钟内）切取新鲜组织，以PBS或生理盐水清洗干净切为小块，立刻放入液氮中冷冻2-3小时后可转入-70℃冰箱保存或着一直保存在液氮中。冻存组织可放入干冰中直接运输，或者以Trizol 4℃下匀浆： 冻存的组织块以液氮研磨后加Trizol或直接加Trizol以电动匀浆器匀浆，匀浆的裂解液干冰运输或短期（5天以内）冷藏（4℃）运输。
二、哺乳动物培养细胞样品采集、保存与运输——使用Trizol试剂（不建议使用RNAlater）
1、悬浮细胞
® 悬浮细胞培养液倒入离心管中，离心沉淀细胞，弃去上清液。
® 细胞沉淀（1×107个细胞）中加入1 ml的Trizol裂解液。
® 反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。- 70℃保存或干冰运输。注：Trizol处理的标本冷藏（4℃）运输，短期（5天以内）亦可。
2、贴壁细胞
® 从培养容器中吸出并弃去培养液。
® 培养瓶中直接加入Trizol试剂，Trizol用量与细胞贴壁面积有关，约15 cm2细胞贴壁面积加入1 ml Trizol。
® 反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。- 70℃保存或干冰运输。注：Trizol处理的标本冷藏（4℃）运输，短期（5天以内）亦可。
注：
1、本市内细胞样品也可以直接常温运送，运送时在培养瓶中装满培养液并以封口膜封口，然而某些实验条件中包含时间限制，建议以Trizol处理。
2、所使用的1.5 ml冻存管或离心管、枪头等必须高温灭菌，装好样品后管口需要以封口膜封好。
3、如需干冰，快递运输所用干冰量至少为8公斤，且运输用泡沫箱需用封箱带密封。