His标签蛋白琼脂糖纯化树脂 蛋白质研究

名称：His标签蛋白琼脂糖纯化树脂 蛋白质研究
编号：SY0392
产地：国产|进口
品Pai：百奥莱博
Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的ZX，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可获取的树脂之一。

基质（Matrix）：高度交联的4%琼脂糖凝胶
孔径（Bead size）：45-165µm
载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）：0.1MPa, 1bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
储存条件：4℃，有效期2年。


使用方法

（一）纯化流程

1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前Z好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤CJ。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶YZ剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清0.22µm或0.45µm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3样品纯化

1）装柱：将Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
3）平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。
4）上样：注意控制加样速度，确保目的蛋白与Ni2+充分接触，以提高纯化得率。
【注】：注意收集流出液，用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。
5）平衡/洗杂：Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。注意收集流出液。
【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）洗脱：使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。
7）清洗：依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
【注】：建议在清洗之前用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
8）保存：5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生

当填料使用过程中发现反压过高，填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；
2）去离子水清洗5倍柱体积；
3）2%SDS清洗3倍柱体积；
4）去离子水清洗5倍柱体积；
5）乙醇清洗5倍柱体积；
6）去离子水清洗5倍柱体积；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；
8）去离子水清洗5倍柱体积；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；
10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。


附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer (pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         0.68g
Wash Buffer (pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         1.36g
Elution Buffer(pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         17.0g

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer (pH8.0)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至8.0, 0.22µm或0.45µm过滤CJ	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O    15.6g Tris              15.76g
Wash Buffer (pH6.3)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至6.3, 0.22µm或0.45µm过滤CJ	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O  15.6g Tris              15.76g
Elution Buffer(pH4.50)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至4.5, 0.22µm或0.45µm过滤CJ	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O    15.6g Tris             15.76g

附表3 Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况

试剂种类	浓度
还原剂	5mM DTE 0.5-1 mM DTT 20mM β-mercaptoethanol 5mM TCEP 10mM reduced glutathione
变性剂	8M urea 6M Gua-HCl
去污剂	2% TritonTM X-100(nonionic) 2% TweenTM20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic)
其他类	500mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100mM Na2SO4 1.5M NaCl 1mM EDTA 60mM citrate
缓冲液	50mM sodium phosphate, pH7.4 100mM Tris-HCl, pH7.4 100mM Tris-acetate, pH7.4 100mM HEPES, pH7.4 100mM MOPS, pH7.4 100mM sodium acetate, pH7.4

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·IRF1-Luc荧光素酶报告基因质粒
编号：SY0077
英文名称：IRF1 luciferase reporter plasmid
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IRF1荧光素酶报告基因（IRF1 luciferase reporter plasimd）是用于检测IRF1转录活性水平为目的的报告基因。IRF1(Interferon Regulatory Factor 1)是IRF家族中被发现的核转录因子，具有广泛的生物学功能，它调节干扰素系统，YZ细胞生长，YZ肿瘤形成。

IRF1报告基因主要用于检测细胞中IRF1的转录活性、药物研究以及基因过表达和RNAi的表型分析等。

pGMIRF1-Lu是我公司改造后的哺乳动物真核表达载体，在其多克隆位点插入了多个IRF1结合位点，可以高灵敏度地检测IRF1的激活水平。同时，对载体中预测出的其它转录因子以外的结合位点进行了适当的突变，增加了质粒的转录因子结合特异性。由于质粒体积减小，使得IRF1报告基因质粒更易于转染。

质粒图谱



注意事项
本质粒未经我公司允许不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人实验室以外的任何人或单位。
为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

使用说明
1.pGMIRF1-Lu可以采用常规转染方法转染哺乳动物细胞。用荧光素酶检测试剂盒或双荧光素酶检测试剂盒进行检测。
2.IRF1的激活剂，可作为IRF1报告基因的阳性对照。

储存条件：-20℃。

·DH5α化学感受态细胞
编号：SY0012
英文名称：DH5α Chemically Competent Cell
规格：100μl×10管
本品是采用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。本品使用pUC19质粒检测，转化效率可达108 cfu/μg，广泛适用于GX的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。本品适用于蓝白斑筛选，另对recA1和endA1进行特定的改造使其更能保证克隆DNA的稳定性。

DH5α感受态细胞基因型：F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-arg ) U169 endA1 recA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1。

储存条件：-80℃
组份：
DH5α感受态细胞 100μl×10
pUC19(0.1 ng/μl) 5μl

注意事项
1）感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2）整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。
3）为确保转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。
4）为防止转化不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，化实验可能遇到的风险。

使用方法
1）取100 μl感受态细胞置于冰浴中融化。
【注】：一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用，应注意所用的DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。
2）向100 μl感受态细胞悬液中加入目的DNA，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min。
3）将离心管置于42℃水浴中放置45s~60s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min，该过程不要摇动离心管。
4） 向离心管中加入900μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45 min~60min（150 rpm）， 目的是促使菌体复苏，抗性基因表达。
5）将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼脂培养基上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，37℃培养12-16 h。
【注】：涂布菌液多少可根据转化DNA量来调整。如果预计的克隆较少，可通过离心后吸除部分培养液，重新悬浮菌体后将其涂布在一个平板上。剩余菌液可置于4℃保存，一周之内可重新涂板。


His标签蛋白琼脂糖纯化树脂 蛋白质研究