His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂厂商

名称：His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂厂商
英文名：Ni-NTA Agarose Resin 6FF
产地：国产|进口
规格：10ml
品Pai：百奥莱博
Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的ZX，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性（可耐受0.3 MPa的压力），该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

基质（Matrix）：高度交联的6%琼脂糖凝胶
孔径（Bead size）：45-165µm
载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）：0.3MPa, 3bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
储存条件：4℃保存，有效期2年

使用方法

（一）纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前Z好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤CJ。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶YZ剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液至离心管中，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3 装柱
1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2）将树脂悬浮，小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4）打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。Z初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用所用泵的流速，这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。【注】：在随后的色谱程序中，不要超过装柱流速的75%。
5）关闭泵，关闭层析柱出口。
6）如使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如需要可重新调整分配器。

4 样品纯化
装柱后，可用各种常规的中压色谱系统，以AKTA使用为例进行说明：
1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
2）3-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。
3）至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1ml/min，5ml预装柱推荐流速为5ml/min。
4）利用泵或注射器上样，收集流出液，以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。【注】：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7）建议用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

5 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa），填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：
1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；
2）去离子水清洗5倍柱体积；
3）2%SDS清洗3倍柱体积；
4）去离子水清洗5倍柱体积；
5）乙醇清洗5倍柱体积；
6）去离子水清洗5倍柱体积；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；
8）去离子水清洗5倍柱体积；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；
10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

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·Anti-His标签亲和纯化凝胶
编号：SY0435
英文名称：Anti-His Affinity Gel
规格：1ml
Anti-His Affinity Gel（Anit-His亲和纯化凝胶）由高质量的鼠源 IgG1单克隆抗体与sepharose 4B gel 通过供价偶联制备，本产品具有较高的His标签融合蛋白加载容量（至少为0.6mg protein/mL凝胶），杂蛋白非特异结合少，可用于带有His标签的融合蛋白免疫沉淀（IP）和纯化。我公司提供的Anit-His亲和纯化凝胶可用于纯化N-端、C-端、4×His、5×His、6×His融合蛋白。

亚型：Mouse IgG1
纯化方法：Protein A
浓度：7.5g抗体/L凝胶
应用：蛋白纯化，免疫沉淀（IP）
蛋白结合量（Protein）：≥0.6 mg蛋白/mL凝胶
储存缓冲液：TBS, 50% 甘油, pH 7.4，含有0.02%（w/v）叠氮钠
储存条件：-20℃，有效期1年

·绿色核酸染料(10000×水溶液)(同DuGreen、GelGreen)
编号：SY0245
英文名称：Green Nucleic Acid Gel Stain (10,000×in Water)
规格：500μl
本产品是一种独特的油性大分子，不能穿透细胞膜进入细胞内，不易挥发升华，人体不会吸入。艾姆斯氏测试结果也表明本产品在凝胶染色浓度下完全没有诱变性，因此相对于EB的强致癌性是一种安全无毒的核酸染料。适用于各种大小片段核酸的电泳染色，对核酸迁移率的影响远小于SYBR Green I。适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶，室温下在酸或者碱性缓冲液中极其稳定，耐光性强。

本产品适用于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳中的dsDNA、ssDNA以及RNA染色，可以选择胶染法或泡染法进行染色，使用非常方便和灵活。同SYBR Green I的光谱性质，适用于使用254nm激发的紫外凝胶成像透射仪或可见光凝胶透射仪观察。

储存条件：4℃，避免强光直射，有效期12个月。

使用方法
一、胶染法（同EB，电泳前染色）
1 制胶时加入本产品核酸染料（每50mL 琼脂糖溶液中加入5μL 本产品10000×水溶液，以此类推）。
2 按照常规方法进行电泳。

注意事项
1）此方法比较节省染料，500 μL染料大约可以做100块 50mL的胶。
2）由于本产品 具有良好的热稳定性，可以直接添加到热的琼脂糖溶液中而不需要等待溶液冷却。摇晃，振荡或者翻转以保证染料充分混匀。也可以选择将本产品储液加到琼脂糖粉末和电泳缓冲液中，然后用微波炉或其他常用方式加热以制备琼脂糖凝胶。
3）本产品兼容所有常用的电泳缓冲溶液。
4）如果总是看到条带弥散或分离不理想，建议使用泡染法染色以确认问题是否与染料有关。如果染色后问题依旧存在，则说明问题与染料无关，请尝试：降低琼脂糖浓度；选用更长的凝胶；延长凝胶时间以保证边缘清晰；改进上样技巧或选择泡染法染色。
5）胶染法不适合预制聚丙烯酰胺凝胶，对于聚丙烯酰胺凝胶请使用泡染法。

二、泡染法（电泳后染色）
1）按照常规方法进行电泳。
2）用H2O将本产品 10000×水溶液稀释约3,300倍到0.1M NaCl中，制成3×染色液。（如将15μL 本产品10,000×水溶液和5mL 1M NaCl加到45mL H2O中）。
3）将凝胶小心地放入合适的容器中，缓慢加入足量的3×染色液浸没凝胶。室温振荡染色30min左右，染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有不同。对于含3.5～10% 聚丙烯酰胺的凝胶，染色时间通常介于30min到1h，并随聚丙烯酰胺含量增加而延长。

注意事项
1）用泡染法染色时，染料用量较多。单次使用的染色液可重复使用3次左右。
2）3×本产品染色液可以大量制备，在室温下避光保存直至用完。


His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂厂商