miRNA调控类腺相关病毒构建与包装

腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或单纯疱疹病毒的辅助。AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组人腺相关病毒。这种系统利用已经明确与调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且将这些基因产物通过转染引进宿主细胞，在AAV Helper-Free System中，生产感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A, E4和VA  RNA基因）大部分由与其他质粒共转染进细胞的pHelper 质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是经过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。
野生型AAV 基因组由病毒rep和cap基因（分别编码和复制基因）及位于两侧的表达和包装必须的顺式作用元件—反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeats, ITRs）组成。在AAV Helper-Free System中，rep和cap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC中， AAV ITRs仍位于病毒载体中，实际上在辅助质粒的帮助下，仅需两端的 ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。Rep和Cap基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的ZD限度。
rAAV是基因传递和表达的一个重要工具。AAV具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。AAV具有广泛的细胞核组织感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。另外，由于这种系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至ZD，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力必须要顾及的。
    AAV感染／转导过程可分为七个阶段，即： (1)AAV与受体的结合，(2)病毒颗粒的内摄， (3)囊泡的运输， (4)内涵体的脱离， (5)核转运， (6)病毒脱壳， (7)中间体双链DNA的合成。目前认为，AAV的细胞内转运和双链DNA合成是限制AAV感染效率的丰要因素。
腺相关病毒应用优势：

具有较高的生物安全级别
腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助，并且目前尚未发现其和任何的人类疾病有关联。同时，在我们的生产的病毒载体中，AAV 反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，从而阻止生产出重组野生型病毒。
宿主细胞范围广
腺相关病毒可感染广泛的哺乳动物细胞，同时其不仅可感染分裂细胞，而且可感染非分裂细胞。与其它病毒载体相比，用于具有免疫活性细胞的基因表达时，腺相关病毒载体效果更好。
物理性质稳定
AAV可保存在常温且其滴度变化极小，同时在60℃都不能被灭活，甚至有文献报道用氯仿均不能灭活AAV。如此稳定的物理性质，相对于其他种类病毒，使得AAV在日常保存及运输中具有极大优势。
低免疫原性
 与已获得临床应用的腺病毒载体相比，AAV 在注射后引起的免疫反应短暂。大剂量全身性特别是尾静脉使用虽然也会导致抗体的产生，但很少有感染上的细胞之后被细胞免疫系统所清除，这被认为与AAV对抗体递呈细胞感染较弱相关。
良好的扩散性
AAV颗粒较小，其粒径是腺病毒的 1/5，慢病毒的 1/4，体积上相差数十倍到100倍，所以 AAV的扩散性远高于这两种病毒。实践已证明，9 型AAV可透过血脑屏障感染神经元和胶质细胞。同时，AAV 用于局部感染肌肉、脑、眼，肝，肾等组织时，重复感染效率较好，这种特性在动物实验中优势明显。
长期稳定的基因表达能力
重组AAV感染细胞后，不会整合到基因组，而是串联形成附加体存在于细胞核中，从而保持长期稳定的基因表达，这对于终末分化的细胞该优点特别明显。
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