全基因组表达谱芯片技术服务

全基因组基因表达谱的检测对疾病研究有非常重要的意义。一方面，基因表达谱的检测可以应用于疾病生物标记物的筛选。另一方面，基因表达谱的检测可以为基因功能研究提供线索，有助于揭示疾病发SF展的分子机制。 虹舜生物为您提供全基因组表达谱芯片技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本及标本信息，虹舜生物就可为您完成全部实验操作及数据分析，为您提供完整的实验报告。 Agilent表达谱芯片产品列表 ： 芯片名称 种属 格式 基因数 Database source Whole human genome 人 4 x 44K ~41,000 Goldenpath, Ensembl, Unigene, Human Genome (Build 33), Refseq, GebBank whole mouse genome 小鼠 4 x 44K ~41,000 USC mRNA known genes, Natl. Institute on Aging, Genbank, Unigene, Refseq, Ensembl, RIKEN whole rat genome 大鼠 4 x 44K ~41,000 Ensembl, UCSC Goldenpath, Unigene, Refseq, Genbank SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K v2 Microarray 人 8 x 60 K ~50,000 RefSeq, Ensemble, Unigene, GenBank, Broad Institute Human lincRNA and TUCP catalog SurePrint G3 Mouse GE 8x60K Microarray 小鼠 8 x 60 K ~40,000 RefSeq, Ensembl, Unigene, GenBank, RIKEN SurePrint G3 Rat GE 8x60K Microarray 大鼠 8 x 60 K ~30,000 RefSeq, Ensembl,Unigene, GenBank Agilent还提供多类物种的表达谱芯片： 动物：兔、猪、斑马鱼、果蝇等            植物：水稻、玉米、拟南芥、烟草等            微生物：大肠杆菌、酵母等 表达谱 芯片特点：  ·  独特的喷墨原位合成技术；  ·  探针长度60mer，可以兼顾灵敏性和特异性，使二者达到良好的平衡；  ·  由于采取长探针设计，有利于捕捉对生命活动有重要意义的低丰度基因；  ·  芯片随数据库及时更新，基因信息更新更全，可升级到芯片版本；  ·  灵活的定制方案，仅需基因组或EST序列，客户即可任意制作自己的芯片；  ·  平均CV＜10%（MAQC：Nature Biotechnology Sept，2006）；  ·  芯片具有良好的可重复性，相关系数R2＞0.95（MAQC）；  ·  芯片数据结果与qPCR数据结果具有良好的相关性，相关系数R2＞0.9（MAQC ）。 表达谱芯片实验流程： 1、数据标准化        对基因芯片数据的标准化处理， 主要目的是消除由于实验技术所导致的表达量(Intensity)的变化，并且使各个样本(sample)和平行实验的数据处于相同的水平，从而使我们可以得到具有生物学意义的基因表达量的变化。对于表达谱芯片，一般采用的标准化方法有分位数标准化（Quantile Normalization）。          芯片原始数据经过标准化处理后，在一个二维直角坐标系平面中，绘制散点图。芯片数据的散点图常用语评估两组数据总体分布集中确实。散点图中每一个点代表芯片上的探针点，该点在二维平面中的位置由其X轴和Y轴坐标确定。 2、差异筛选统计分析 单因素两组数据统计分析     对于同一影响因素下的2组数据，每组数据3个以上生物学重复的实验设计，采取T-Test方法进行单因素统计分析。例如试验组3个样本，对照组3个样本，比较两组间的差异基因     b．图形数据       单荧光芯片数据组间T-Test分析得到p-value值与FC值，两个因素共同绘制火山图（Volcano Plot），用于显示两组样数据的显著性差异。在火山图中，横坐标显示两组比较下log2转换后的倍数差异值，纵坐标显示由T-Test计算出来的-log10(pvalue)。 3、聚类分析     为了全面而直观地展示样品之间的关系及基因表达差异情况，将表达基因做层次聚类分析。用挑选的基因的表达情况来计算样品直接的相关性。一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇（Cluster）中，聚在同一个簇的基因可能具有类似的生物学功能。 4、主成分分析（PCA） PCA（Principal Component Analysis）的原理是找到数据方差的两个或者三个主成分（向量），将数据投影在这些主成分上，以达到降维的目的，通过图像上的点之间的相互距离来显示样本之间的相似度。通过PCA分析，可以观察样本的分布情况，验证试验设计的合理性，考察生物学重复样本的均一性。各组样本分布在二维空间的不同区域，同组的样品在空间分布比较集中，说明这些基因选取具有代表性。 5、样本相关性分析       6、GO分析     Gene Ontology（简称GO）是基因功能国际标准分类体系。GO可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（Biological Process）和细胞组成（Cellular Component）三个部分。GO-Analysis对差异基因等按GO分类，并对分类结果进  行基于离散分布的显著性分析、误判率分析、富集度分析，得出与实验目的有显著联系的、低误判率的、靶向性的基因功能分类，该分类即导致样本性状差异的Z重要的功能差别。通过该分析有可能找到导致性状变化的重要功能，并且找到该功能所对应的基因。       7、Pathway分析     信号通路（Pathway）是多个基因间相互作用，共同调节细胞功能和代谢活动的过程。而信号通路分析是通过对差异基因按照Pathway的主要公共数据库KEGG来进行分类，得到与实验目的有显著联系的Pathway 类别。   8、基因表达趋势分析（STC）       对于按照处理时间、浓度、疾病恶化程度顺序设计的序列实验，为了筛选出随样本顺序变化影响Z显著、Z主流的基因群，需要对样本的差异基因进行基因表达趋势分析。应用模糊聚类等机器学习方法，计算出随着时间、浓度梯度或恶性程度等变化过程中基因的表达趋势，得到相应的主流表达趋势，其所属基因的表达变化是与时间、浓度或恶性程度具有显著性联系的基因，主流表达趋势所属基因将作为进一步研究的目标基因。

 
表达谱芯片样本准备：
一、动物组织样品保存与运输（每张芯片需50-100mg组织）
1、新鲜组织样品的保存与运输
A、使用RNAlater试剂

• 取新鲜组织（注：生物体死亡后尽快在10分钟内取材），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在0.5 cm以下（长宽不限），然后放入装有5倍体积RNAlater的离心管（或冻存管）中。
• 4℃孵育过夜，此时样品管需要横置以便组织块充分接触到RNAlater，然后转入- 20℃中保存。样品在- 20℃不会冻结，但是溶液中可能有一些晶体出现，这并不影响后续的RNA抽提。冻存样品也可以反复冻溶，其RNA含量和完整性不受影响。
• RNAlater处理的标本可用常规冰袋4℃低温运输（无需使用干冰- 70℃运输）。

B、使用Trizol试剂
Trizol试剂可YZRNA酶活性，破坏细胞膜结构以裂解细胞释放出RNA。

• 取新鲜组织（注：生物体死亡后1分钟内取材料并保存好），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，每50~100 mg组织加1 ml Trizol溶液匀浆裂解组织样品，操作Z好在冰上进行。
• 匀浆的裂解液4℃短期保存（1个月），-20度或- 70℃长期保存。干冰运输，短期（5天以内）冷藏（4℃）运输亦可。

2、冻存组织的保存与运输
生物体死亡后尽快（Z好在10分钟内）切取新鲜组织，以PBS或生理盐水清洗干净切为小块，立刻放入液氮中冷冻2-3小时后可转入-70℃冰箱保存或着一直保存在液氮中。冻存组织可放入干冰中直接运输，或者以Trizol 4℃下匀浆： 冻存的组织块以液氮研磨后加Trizol或直接加Trizol以电动匀浆器匀浆，匀浆的裂解液干冰运输或短期（5天以内）冷藏（4℃）运输。
 
二、哺乳动物培养细胞样品采集、保存与运输——使用Trizol试剂（不建议使用RNAlater）
1、悬浮细胞

• 悬浮细胞培养液倒入离心管中，离心沉淀细胞，弃去上清液。
• 细胞沉淀（1×10⁷个细胞）中加入1 ml的Trizol裂解液。
• 反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。- 70℃保存或干冰运输。注：Trizol处理的标本冷藏（4℃）运输，短期（5天以内）亦可。

2、贴壁细胞

• 从培养容器中吸出并弃去培养液。
• 培养瓶中直接加入Trizol试剂，Trizol用量与细胞贴壁面积有关，约15 cm²细胞贴壁面积加入1 ml Trizol。
• 反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。- 70℃保存或干冰运输。注：Trizol处理的标本冷藏（4℃）运输，短期（5天以内）亦可。